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目的：多发性骨髓瘤（MM）是严重影响人类健康进而威胁人类生命的一种血液系统恶性肿瘤。目前关于多发性骨髓瘤的发病机制尚未完全明了，其治疗方法主要为联合化疗，并辅以抑制血管新生、免疫治疗及造血干细胞移植等。由于化疗对骨髓及其它脏器具有严重的毒副作用，因而影响患者的生活质量并限制临床治疗效果。本实验的目的在于探讨多发性骨髓瘤的部分发病机制，尤其是抑癌基因（p15基因）CpG岛甲基化在多发性骨髓瘤发生发展中的作用及其在指导治疗中的意义，探讨其作为一种基因标志用于检测多发性骨髓瘤微小残留病（MRD）的可能性。进一步筛选5-杂氮-2’-脱氧胞嘧啶（5-aza-deoxycytidine，5-aza-CdR）、肝脂素及亚砷酸能否通过逆转甲基化，恢复p15基因表达而发挥抗肿瘤作用，为临床去甲基化治疗奠定基础。 方法与结果：首先用酚-氯仿方法提取多发性骨髓瘤细胞的基因组DNA，经热变性法获得单链DNA后用亚硫酸氢钠（NaHSO3）硫化处理，然后采用甲基化特异性PCR（Methylation Specific Polymerase Chain Reaction，MSP）方法检测多发性骨髓瘤细胞p15基因CpG岛甲基化状态，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。p15基因CpG岛甲基化者可见到一条148bP的PCR产物，而非甲基化者则可见到一条154bP的PCR产物。22例多发性骨髓瘤患者MSP检测结果：p15基因CpG岛甲基化率为63.6％。出现甲基化阳性条带的样本，大多数同时伴有非甲基化条带。完全缓解（Complete Remission，CR）期，初发及复发组多发性骨髓瘤患者p15基因CpG岛甲基化率分别为33.3％、66.7％和85.7％，呈现逐渐增高的趋势。初发组和复发组患者p15基因甲基化率明显高于CR期患者，但统计学显示无显著性差异（P＞0.05）；复发组患者的p15基因甲基化率虽然高于初发组，但也无显著性差异（P＞0.05）。Ⅰ、Ⅱ期多发性骨髓瘤患者同Ⅲ期患者p15基因CpG岛甲基化率无明显差异。临床可判定疗效的21例多发性骨髓瘤患者中13例发生p15基因甲基化者临床治疗有效率为30.8％，而8例p15基因非甲基化患者治疗有效率为87.5％，统计学分析具有显著性差异（P＜0.05）。 为了研究CdR、肝脂素及亚砷酸是否具有逆转Raji细胞株P15基因CpG岛高甲基化的作用，我们使用反转录PCR（Reverse trans。ription Polymerase ChainReaction，RT一PCR）的方法检测上述三种药物作用前后P15基因mRNA的表达情况。首先用Tri 201提取总RNA，然后经反转录合成cDNA，进一步以cDNA为模板，设计跨越p巧基因两个外显子的引物进行35个循环的PCR扩增。 P15基因有表达者可见到一条420bp的扩增产物。我们对三种药物作用前后Raji细胞p15基因mRNA的表达情况显示:Raji细胞的P15基因CpG岛为高甲基化状态，电泳结果未检测到42Obp的p巧基因mRNA扩增条带;HL一60细胞的P15基因CPG岛为非甲基化状态，电泳显示一条420bp的mRNA阳性扩增条带;Raji细胞经5 x10一6M cdR作用%小时后电泳显示一条42Obp的阳性扩增条带;Raji细胞经25Oug/ml肝脂素作用16小时后测定结果显示基因表达量同对照组比较未见明显上调;Raji细胞经12.suM亚砷酸处理48小时后电泳显示一条420bp的阳性扩增条带。 结论:通过以上实验证明在多发性骨髓瘤中p15基因确有较高频率的CPG岛异常甲基化，与文献报道基本一致。发生甲基化的患者对化疗反应性差，临床缓解率低。pls基因CpG岛甲基化同临床分期之间无明显相关性提示其可能是多发性骨髓瘤发病中的一个早期作用环节。正常及非累及骨髓的血液病患者骨髓细胞的P15基因处于非甲基化状态，这说明p15基因CpG岛甲基化为包括多发性骨髓瘤在内的某些恶性血液病细胞所特有。MSP方法的敏感性高，因此使用MSP方法检测p巧基因CpG岛的甲基化状态将有可能成为检测多发性骨髓瘤微小残留病灶的一个重要指标并用于指导治疗。多发性骨髓瘤中如此高频率的P15基因CPG岛异常甲基化提示我们去甲基化治疗可能是一种有效的治疗方法，因异常甲基化而失活的抑癌基因对去甲基化制剂的诱导非常敏感也使得这一设想更加可行。RT一PCR结果显示CdR和亚砷酸具有明确的去甲基化作用，能够使P15基因重新恢复表达，与文献报道一致，但是肝脂素在本次实验中未发现明确的去甲基化作用，这说明肝脂素抗肿瘤的作用机理并非通过逆转甲基化而实现.通过本次的实验研究证明CdR和亚砷酸辅助治疗多发性骨髓瘤具有实验依据。