四霉素对互隔交链孢霉菌的抑菌机制

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互隔交链孢霉菌(Alternaria alternata)是猕猴桃软腐病的致病菌之一,该致病菌易引起猕猴桃果实腐烂变质,使其失去经济价值,严重制约了猕猴桃产业的健康稳定发展。四霉素(Tetramycin)属多烯大环内酯类抗生素,对植物病原菌具有较强的抑菌作用。四霉素在生产应用方面的研究较多,但其抑菌机理尚不明确,关于其抑菌机制方面的系统研究也未见报道。因此,本论文以A.alternata为靶标菌,从生理代谢和分子水平探索了四霉素对该病原菌的作用机制。主要研究结果如下:(1)明确了“红阳”猕猴桃软腐病病原菌为互隔交链孢霉菌(A.alternata)。采用组织分离法从“红阳”猕猴桃病果中分离获得致病菌株W-1。结合形态学和分子生物学鉴定,明确致病菌为互隔交链孢霉菌(A.alternata)。该菌最适生长温度和p H分别为28℃和7~8,最适碳源为淀粉或葡萄糖,最适氮源为酵母膏或蛋白胨。(2)四霉素对A.alternata菌丝生长、孢子萌发和侵染致病具有优异的抑制效果。采用菌丝生长速率法、孢子萌发法以及活体接种法评价了四霉素对A.alternata的抑菌活性。结果表明,四霉素对菌丝生长的抑制中浓度(EC50值)为0.1080μg·m L-1,最小抑菌浓度(MIC)为0.90μg·m L-1。不同浓度四霉素均可显著抑制病原菌的菌丝生长、孢子萌发以及A.alternata对猕猴桃果实的致病力,并且还能导致菌丝产生大量分支和突起,使其不能正常延伸生长。其中,0.80μg·m L-1四霉素处理对病原菌菌丝生长抑制率、菌丝干重抑制率和孢子萌发抑制率分别为89.03%、94.42%和96.58%,对A.alternata在猕猴桃果实上的致病力抑制率达90%以上。(3)通过扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)观察,证实了四霉素能破坏A.alternata菌丝微观形态结构。四霉素处理A.alternata菌丝12 h后,SEM观察发现病原菌菌丝严重皱缩干瘪、扭曲折叠,甚至出现孔洞或发生断裂。TEM观察发现菌丝体细胞壁边界模糊不清,细胞内含物质明显减少,出现严重质壁分离和空泡化现象。(4)四霉素通过提高A.alternata几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶活性及相关基因的表达从而破坏细胞壁结构。通过钙荧光白(CFW)染色,发现四霉素处理后菌丝荧光较少、分布不均,说明菌丝细胞壁几丁质含量下降。进一步研究表明,四霉素处理下A.alternata几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶的活性显著增加,且与之相关的Chit基因和β-1,3-glu基因发生过量表达,从而引起细胞壁水解。(5)四霉素可通过破坏病原菌细胞膜完整性并影响其正常的能量代谢,进而抑制其生长发育。四霉素处理下A.alternata细胞内核酸和蛋白质等细胞内容物大量外渗,菌丝悬浮液电导率升高,菌丝及孢子经碘化丙啶染色后出现红色荧光,丙二醛(MDA)显著上升,菌丝体内麦角甾醇含量显著下降,表明病原菌细胞膜完整性已被破坏。另外,四霉素处理后病原菌呼吸速率下降,能量代谢异常,导致病原菌生长受到抑制。
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