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第一部分ITK-SYK融合基因过表达载体构建以及细胞转染目的:ITK-SYK是非特指外周T淋巴瘤中最新发现的一种融合基因,对外周T淋巴瘤的发生发展有着重要作用。我们通过构建ITK-SYK融合基因的过表达慢病毒载体,转染Jurkat细胞使其表达SYK融合蛋白。同时观察慢病毒载体感染Jurkat细胞后的生物学行为变化。方法:用PCR方法分别扩增ITK,SYK基因片段,然后采用Fusion PCR方法将ITK、SYK基因融合,形成ITK-SYK融合基因。将融合基因片段插入到慢病毒过表达载体。通过酶切测序比对分析插入基因片段,测序成功后包装病毒感染Jurkat细胞。通过荧光显微镜,流式检测以及Western blotting实验分析融合基因ITK-SYK在细胞系中表达情况。采用CCK-8,软琼脂克隆实验、ELISA分析ITK-SYK融合基因对Jurkat细胞的生物学行为特性的影响。结果:PCR方法扩增出ITK、SYK片段产物以及融合基因片段后进行凝胶电泳,发现在500bp,1000bp,1500bp处出现条带。同时将融合基因片段插入慢病毒载体后进行酶切测序,结果比对证实成功构建ITK-SYK融合基因的慢病毒载体。慢病毒载体感染细胞后在荧光显微镜下检测到增强绿色荧光蛋白（EGFP）表达,流式分析检测到细胞的转染率为85.23%,western blotting检测到融合蛋白SYK的表达。CCK-8实验提示转染细胞的增殖增加,软琼脂克隆实验发现转染ITK-SYK组细胞克隆数目增多,以及ELISA方法检测到转染ITK-SYK组细胞细胞因子IL-2分泌增加。结论:成功构建ITK-SYK融合基因,并且观察到转染融合基因的细胞生长增殖速度增加,克隆能力增强,IL-2分泌增加,进一步探索引起生物学行为改变的分子机制。第二部分基因芯片检测ITK-SYK引起Jurkat细胞基因改变目的:通过基因芯片分析对照和ITK-SYK基因融合的外周T淋巴瘤中的差异表达基因,并对其进行聚类分析,注释和归类,显著性分析和网络分析,筛选出与肿瘤发生相关的信号通路,在整体水平上探索ITK-SYK融合基因的发病机制。方法:将对照和ITK-SYK慢病毒载体转染的Jurkat细胞进行全基因表达谱测序,对差异基因进行聚类分析。基于GO（Gene Ontology）数据库,对差异基因进行基因功能注释,筛选差异基因所体现的显著性功能。基于KEGG数据库,对差异基因参与的pathway进行差异性分析,筛选出差异性通路。利用KEGG数据库中的基因与基因产物的相互作用关系,发现差异基因之间的作用关系,定位上游与下游蛋白,从而构建基因的相互作用网络。结果:与对照组相比,ITK-SYK+Jurkat细胞存在722个差异表达基因,其中278个基因显著上调,444个基因显著下调。这些差异基因进行注释,主要参与细胞周期,凋亡,DNA修复,信号转导,和细胞增殖等生物学功能,涉及肿瘤,PI3K/Akt、MAPK、JAK/STAT信号通路。基因相互作用表明JAK3与STATs之间具有高度相关性,提示JAK/STAT通路激活。结论:融合基因对外周T淋巴瘤的作用并不是单个分子的生物学行为,通过融合基因引起的上述的生物学功能以及信号通路之间的相互交叉,互相影响,形成了ITK-SYK融合基因外周T淋巴瘤的分子基础。第三部分ITK-SYK引起Jurkat细胞JAK/STAT通路激活目的:根据基因芯片结果分析,JAK/STAT通路在ITK-SYK融合基因外周T淋巴瘤中发挥重要作用。本研究首先验证JAK/STAT通路蛋白在ITK-SYK融合基因外周T淋巴瘤中表达情况,进一步观察JAK3特异性抑制剂托法替尼（tofacitinib）对转染ITK-SYK融合基因的肿瘤细胞生物学行为影响,以及对ITK-SYK融合基因外周T淋巴瘤移植小鼠瘤负荷影响。方法:慢病毒载体感染Jurkat细胞,western blotting检测比较对照和ITK-SYK组JAK家族总蛋白以及磷酸化水平改变,根据基因芯片结果提示,检测两组细胞下游STAT3和STAT5总蛋白以及磷酸化水平改变,同时计算磷酸化蛋白/总蛋白比例。以转染ITK-SYK融合基因的Jurkat细胞为观察对象,通过CCK-8检测分别观察不同时间不同浓度的特异性JAK3抑制剂对细胞的活力改变情况。Western blotting检测不同浓度的特异性JAK3抑制剂对细胞下游STAT5总蛋白和磷酸化蛋白水平影响。流式检测JAK3抑制剂对细胞凋亡和周期改变。Western blotting检测细胞凋亡、周期蛋白变化。建立移植小鼠模型,以ITK-SYK融合基因阳性小鼠为观察对象,比较用药组与对照组之间肿瘤体积变化,荧光检测小鼠体积改变以及免疫组化检测SYK蛋白改变。结果:与ITK-SYK-Jurkat细胞相比,ITK-SYK+Jurkat细胞中的JAK1,JAK2和TYK2蛋白水平没有明显变化,JAK3蛋白水平轻微升高,磷酸化的JAK3蛋白水平明显升高。下游的STAT3,STAT5蛋白水平并没有明显变化,p-STAT5在ITK-SYK+Jurkat细胞中有表达而不是p-STAT3。使用0,0.5,2.5,5μM的抑制剂托法替尼分别作用于ITK-SYK+Jurkat细胞和ITK-SYK-Jurkat细胞6,18,24,48小时后,观察到特异性JAK3对ITK-SYK+Jurkat细胞的抑制作用呈浓度时间依赖性（2.5μM托法替尼作用48小时抑制率为50%）,然而对ITK-SYK-Jurkat细胞并没有明显的抑制作用。2.5μM特异性JAK3抑制剂作用于ITK-SYK+Jurkat细胞后,磷酸化水平的STAT5蛋白表达完全抑制。0,0.5,2.5,5μM托法替尼作用ITK-SYK+Jurkat细胞24小时后,观察到用2.5μM托法替尼处理的细胞显示出更高的凋亡率（托法替尼17.11%对比对照4.12%,p<0.001）,抑制剂增加至5μM浓度时,凋亡率反而下降。Western blotting检测出托法替尼处理组中裂解的半胱天冬酶-3的蛋白表达水平增加以及全长半胱天冬酶-3的蛋白表达水平降低。流式检测细胞周期显示G1/S期细胞数量明显增加,细胞停滞在G1/S期。Western blotting检测到P27蛋白水平增加和CDK2蛋白水平降低。5×106个ITK-SYK+CEM细胞皮下接种到小鼠体内。给予托法替尼（20mg/kg/天）或等同的PBS连续口服28天。与对照小鼠相比,在实验结束时,用托法替尼处理的小鼠显示出肿瘤生长的延迟。在第13天,托法替尼对肿瘤生长的抗肿瘤作用潜力是明显的。与对照组相比,小鼠体内活体成像观察到托法替尼治疗组中肿瘤生长被明显抑制。同时免疫组化检测到对照组中SYK蛋白的免疫染色强度显着强于托法替尼组。结论:ITK-SYK融合基因可以引起Jurkat细胞JAK3,STAT5蛋白磷酸化水平升高。使用特异性JAK3抑制剂托法替尼,可以引起体外ITK-SYK+Jurkat细胞增殖活力下降,凋亡水平增加,周期阻滞在G1/S期,体内小鼠肿瘤生长受抑制。第四部分ITK-SYK引起JAK/STAT通路激活依赖于IL2RG受体目的:JAK3是一种酪氨酸激酶,通过共同的γ链（IL2RG）受体参与细胞因子通路,参与细胞的增殖、分化和凋亡等过程。通过沉默IL2RG,观察对细胞生物学行为的改变。方法:以ITK-SYK+Jurkat细胞为观察对象,将三种不同的抗IL2RG的si RNA和无义si RNA（对照组）用电转的方法转染到ITK-SYK+Jurkat细胞,筛选出有沉默作用的si RNA。以ITK-SYK+Jurkat细胞为观察对象,实验分两组,实验组（抗IL2RG的si RNA）和对照组（无义si RNA）。给实验组额外添加IL-2,IL-21。Western blotting分析实验组和对照组以及加IL-2,IL21的四组细胞的JAK3,STAT5总蛋白以及磷酸化蛋白表达水平变化,同时计算出磷酸化蛋白/总蛋白比例。以细胞计数绘制生长曲线检测两组细胞增殖变化。流式检测两组细胞凋亡周期变化,同时Western blotting分析凋亡、周期蛋白表达变化。ELISA检测四组细胞（IYK-SYK—Jurkat组,ITK-SYK+Jurkat组,抗IL2RG的si RNA组,无义si RNA组）的细胞因子水平变化,并用Western blotting分析IL受体蛋白变化。结果:我们分析三种IL2RG特异性si RNA对ITK-SYK+Jurkat细胞中IL2RG抑制作用。与si IL2RG-1和si IL2RG-3相比,Si IL2RG-2有效抑制IL2RG的水平。生长曲线显示IL2RG敲低对ITK-SYK+Jurkat细胞存活产生明显的抑制作用,其随处理持续时间（24小时,48小时,72小时,96小时）而增加。类似地,与si RNA处理的对照相比,IL2RG敲低诱导ITK-SYK+Jurkat细胞凋亡增加。与通过流式细胞术获得的结果一致,在si IL2RG处理组中观察到裂解的半胱天冬酶-3的水平增加以及全长半胱天冬酶-3的水平降低。细胞周期分析显示si-IL2RG处理的ITK-SYK+Jurkat细胞中G1/S期细胞数量显着增加（对照76.23%对比si IL2RG-2 92.31%,p<0.01）。与G1/S期阻滞一致,在用si IL2RG-2处理后,Western blotting检测到ITK-SYK+Jurkat细胞中P27蛋白水平增加和CDK2蛋白水平降低。然后我们研究了ITK-SYK+Jurkat细胞中与IL2RG相关的细胞因子的分泌。与ITK-SYK—Jurkat细胞相比,ITK-SYK+Jurkat细胞中IL-2和IL-21的分泌增加,而IL-4,IL-7,IL-9和IL-15的分泌没有明显改变。与无义si RNA对照相比,IL-2RG敲低的ITK-SYK+Jurkat细胞中的IL-2和IL-21产生并没有明显变化。Western blotting分析si IL2RG-2对IL2RG的沉默抑制了ITK-SYK+Jurkat细胞中JAK3和STAT5的活性,而空载体不影响JAK3或STAT5磷酸化。同时,外源性IL-2（25ng/ml）和IL-21（25ng/ml）不能恢复由si IL2RG-2引起的变化。与细胞因子一致,我们发现IL2R和IL21R的表达水平在ITK-SYK+Jurkat细胞中升高,而IL7R的表达水平降低。结论:JAK3/STA5磷酸化依赖于ITK-SYK+Jurkat细胞中IL2RG的存在,并且与IL-2和IL-21的分泌相关。所有这些数据都强烈表明ITK-SYK融合基因的外周T淋巴瘤中IL2RG/JAK3/STAT5通路激活。