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成纤维细胞是皮肤真皮中的主体细胞成分,在皮肤老化过程中扮演着重要的角色。成纤维细胞合成弹性蛋白减少、弹性纤维减少、卷曲,使皮肤弹性下降、松弛,出现皱纹。目的:本课题着眼于与皮肤衰老密切相关的皮肤成纤维细胞,研究IGF-I、醛固酮对皮肤成纤维细胞增殖的影响,同时通过研究IGF-I、醛固酮对皮肤弹性蛋白的合成的影响,探讨醛固酮发挥作用的途径,观察醛固酮对IGF-I信号通路的影响、作用靶点,并探讨其可能机制。方法:1.MTT法检测不同时间不同浓度IGF-I对皮肤成纤维细胞增殖的影响,分为调零组、对照组、50ng/ml IGF-I、100ng/ml IGF-I、200ng/ml IGF-I、500ng/ml IGF-I组,连续观察12h,24h,48h,72h,96h。2.MTT法检测不同时间不同浓度醛固酮对皮肤成纤维细胞增殖的影响:调零组、对照组、10nmol/L醛固酮、50nmol/L醛固酮、1μmol/L醛固酮组,连续观察12h,24h,48h,72h,96h。3.免疫荧光法检测不同浓度IGF-I对弹性蛋白的调节:制作细胞爬片,按照50ng/ml IGF-I、100ng/ml IGF-I、200ng/ml IGF-I、500ng/ml IGF-I浓度梯度加药,并设阴性对照。4.免疫荧光法检测不同浓度醛固酮对弹性蛋白的调节:按照10nmol/L醛固酮、50nmol/L醛固酮、1μmol/L醛固酮浓度梯度加药,并设阴性对照。5.免疫荧光法检测醛固酮对弹性蛋白调节机理的探讨:根据实验结果筛选出最佳浓度醛固酮,分别与最佳浓度IGF-I、极量IGF-I以结合全部IGF-I受体、醛固酮受体拮抗剂安体舒通共同孵育细胞,并设阴性对照。酪氨酸酶抑制剂分别与最佳浓度的醛固酮、IGF-I作用于细胞,磷脂酰基醇抑制剂分别与最佳浓度的醛固酮、IGF-I作用于细胞,并设阴性对照,细胞免疫荧光及共聚焦观察弹性蛋白的变化。7.Western blot半定量检测醛固酮对弹性蛋白调节机理的探讨,进一步印证免疫荧光的结果。结果:1.MTT法检测不同时间不同浓度IGF-I对皮肤成纤维细胞增殖的影响:与对照组相比50ng/ml IGF-I、100ng/ml IGF-I与200ng/ml IGF-I组有明显差异,大于对照组,P<0.05;与50ng/ml IGF-I比较100ng/ml IGF-I与200ng/ml IGF-I组有明显差异,大于该组,P<0.05;100ng/ml IGF-I与200ng/ml IGF-I组间无明显差异。与对照组比较500ng/ml IGF-I组有明显差异,小于对照组,P<0.05。2.MTT法检测不同时间不同浓度醛固酮对皮肤成纤维细胞增殖的影响:与对照组相比各时间段50nmol/L醛固酮组及12h、96h10nmol/L醛固酮组有明显差异,大于对照组,P<0.05;各时间段50nmol/L醛固酮组与10nmol/L醛固酮比较有明显差异,大于该组,P<0.05。1μmol/L醛固酮组与对照组比较有明显差异,小于对照组,P<0.05。3.免疫荧光法检测不同浓度IGF-I对弹性蛋白的调节:50ng/ml IGF-I组、100ng/ml IGF-I组、200ng/ml IGF-I组、与空白对照组比较,随着IGF-I浓度的增加,成纤维细胞内弹性蛋白的比例逐渐增加,100ng/ml IGF-I组、200ng/ml IGF-I组为最佳浓度组,500ng/ml IGF-I组与空白对照相比较,比例下降。4.免疫荧光法检测不同浓度醛固酮对弹性蛋白的调节:10nmol/L醛固酮组、50nmol/L醛固酮组、并与空白对照组比较,发现随着醛固酮浓度的增加,成纤维细胞内弹性蛋白的比例逐渐增加,50nmol/L醛固酮组为最佳浓度。1μmol/L醛固酮组与空白对照相比较,未见明显变化。5.免疫荧光法、Western Blot法检检测醛固酮对弹性蛋白调节机理的探讨发现:与50nmol/L醛固酮组相比,50nmol/L醛固酮+安体舒通2um/ml组、50nmol/L醛固酮+100ng/ml IGF-I成纤维细胞内弹性蛋白的比例增加,50nmol/L醛固酮+1000ng/ml IGF-I组成纤维细胞内弹性蛋白的比例降低,各组成纤维细胞内弹性蛋白的比例均高于空白细胞组。与空白对照相比,100ng/ml IGF-I+酪氨酸激酶抑制剂组比例增加,余醛固酮50nmol/L+酪氨酸激酶抑制剂1umol/L组、醛固酮50nmol/L+磷脂酰基醇抑制剂1umol/L组、100ng/ml IGF-I+磷脂酰基醇抑制剂1umol/L组未见明显变化。100ng/ml IGF-I+酪氨酸激酶抑制剂PP210umol/L共同孵育细胞,弹性蛋白的量增多;50nmol/L醛固酮+1000ng/ml IGF-I组、醛固酮50nmol/L+酪氨酸激酶抑制剂1umol/L组、醛固酮50nmol/L+磷脂酰基醇抑制剂1umol/L组、100ng/ml IGF-I+磷脂酰基醇抑制剂1umol/L组弹性蛋白的未见明显变化。结论:1.IGF-I在50ng/ml-200ng/ml浓度范围内与皮肤成纤维细胞的增生呈剂量效应关系,且在100ng/ml-200ng/ml浓度时促进增生作用显著。高浓度IGF-I对细胞增殖有抑制作用。2.50nmol/L醛固酮组促皮肤成纤维细胞增生作用最显著,高浓度醛固酮1μmol/L对细胞增殖有抑制作用。3.IGF-I在50ng/ml-200ng/ml浓度范围内随着浓度增加,能有效促进成纤维细胞弹性蛋白的合成,最佳浓度为100ng/ml-200ng/ml IGF-I;高浓度IGF-I(500ng/ml)有抑制成纤维细胞产生弹性蛋白的作用。4.醛固酮能增加弹性蛋白的合成呈剂量依赖性(最佳浓度为50nmol/L),醛固酮受体抑制剂安体舒通不能消除此作用,提示其发挥作用是通过非醛固酮受体依赖的途径。5.醛固酮能明显增加IGF-I受体酪氨酸磷酸化,而且IGF-I受体酪氨酸激酶抑制剂可以抑制醛固酮诱导的弹性蛋白的合成。因此推断醛固酮促进弹性蛋白合成是通过一个非醛固酮受体依赖性通路即IGF-I受体信号通路来完成。6.磷脂酰基醇抑制剂可以消除醛固酮及IGF-I对弹性蛋白的影响,提示醛固酮对弹性蛋白的影响不是通过醛固酮受体发挥作用,而是通过活化IGF-I受体,从而导致下游的PI3激酶/AKT信号系统来完成。由于类固醇激素很容易渗透皮肤,当外用时类固醇透入皮肤,并刺激弹性蛋白的合成对延缓皮肤衰老提供一个新思路。