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第一部分脊髓损伤动物模型的建立及评价目的:1.建立合适的脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)大鼠模型;2.观察并验证神经元在SCI后的形态变化及凋亡情况。研究方法:1.将雄性SD大鼠54只(体重273-282g),随机分成空白对照组(Blank,3只)、假手术组(Sham,18只)和脊髓损伤组(SCI,33只)。2.SCI大鼠的造模采用动脉瘤钳夹法(目标节段为T10,动脉瘤夹标定力量70 g,钳夹持续时间30s)。假手术组(Sham)大鼠手术显露T10脊髓节段后,旷置4分钟后缝合。Blank大鼠不予手术。3.对T10及周围脊髓组织取材:随机选取Sham组大鼠3只在手术后72h取材;SCI大鼠18只,在造模后6个时间点分别随机抽取3只大鼠取材(12h、24h、48h、72h、7d、14d);Blank大鼠在体重=278±2g取材。将取材组织制作成冰冻切片。4.神经行为学评分:采用BBB评分;对脊髓损伤组和假手术组大鼠进行评分(SCI组15只;Sham组15只),记录术前以及术后12h、24h、48h、72h、7d、14d共7个时间点的BBB评分。5.取不同组的大鼠脊髓冰冻切片进行尼氏染色(Nissl染色),观察神经元的形态及尼氏小体的变化。进行TUNEL染色观察神经元凋亡情况。结果:大鼠在造模后即发生全瘫(BBB Score=0),72h的BBB评分略微波动(0.43±0.40),在7d出现明显的上升(8.03±0.53);Sham组大鼠术后24h内BBB评分较正常略有下降(24h:20.33±0.61),48h后恢复正常(BBB Score=21)。尼氏染色见脊髓损伤后神经元的尼氏小体逐渐减少,72h最少,之后稍有恢复。TUNEL染色见脊髓损伤大鼠在72h神经元凋亡数量最大。Sham组与Blank组切片,两种染色后的结果均接近。结论:本研究利用的动脉瘤夹钳夹法可成功制备急性脊髓损伤大鼠模型,是一种经济、可靠的建模方法。本组研究发现SCI后72h的神经元凋亡是峰值。第二部分Miro1在大鼠脊髓损伤不同时间段的变化目的:1.观察Miro1在SCI后的变化规律;2.明确Miro1变化与神经元凋亡的关系。研究方法:1.雄性SD大鼠54只(体重276-285g),随机分成空白对照组(Blank,6只)、假手术组(Sham,9只)和脊髓损伤组(SCI,39只)。SCI造模、Sham组及Blank组处理同第一部分。2.随机选取Sham组大鼠6只、SCI组大鼠36只与6只Blank大鼠分别取材,提取脊髓的RNA及总蛋白。Sham组在空白手术后72h进行;SCI组在6个时间点进行(12h、24h、48h、72h、7d、14d)n=6×6;Blank组大鼠在体重=278±2g时取材。3.采用qRT-PCR定量检测SCI组6个不同时间点及Blank、Sham组大鼠的T10节段Miro1的基因表达情况(n=3);采用Western-Blot法检测Miro1的表达量(n=3)。4.Sham组及SCI组在术后72h各取三只大鼠制作脊髓冰冻切片(n=3),采用免疫荧光法对其Miro1表达阳性的神经元和星形胶质细胞观察和计数。结果:qRT-PCR:SCI后T10节段Miro1的基因表达量逐渐增高,在72h达峰,后有所回落,至14d仍高于对照组。Western-Blot:SCI后T10节段Miro1的表达量增高,72h达最大值。免疫荧光染色:神经元及星形胶质细胞中均可见Miro1的阳性表达;SCI-72h组脊髓节段Miro1表达阳性的神经元细胞占总神经元细胞的比率较Sham对照组明显增高(p<0.01);星形胶质细胞增多,Miro1表达阳性的细胞亦增多(p<0.01)。结论:Miro1在脊髓损伤之后会出现反应性增高;其变化趋势与神经元凋亡趋势吻合,Miro1可能参与调控了大鼠脊髓损伤后神经细胞的凋亡过程。第三部分Miro1在脊髓损伤中对神经元凋亡的抑制及其机制探讨目的:1.抑制SCI后Miro1在脊髓中的表达并验证;2.观察神经元凋亡情况及脊髓功能的改变;3.观察与Miro1可能相作用的线粒体转运分子及凋亡相关分子表达的变化,并探索Miro1对SCI后神经元凋亡的影响机制。研究方法:1.雄性SD大鼠60只(体重273-282g),随机分为空白对照组(Sham)、生理盐水对照组(NS)、溶剂对照组(MOCK)和实验组(Si RNA)四组。Sham组接受空白手术,同前两部分;其余三组显露T10节段:NS组在T10节段以微量注射泵推注生理盐水8μl;MOCK组推入转染试剂8μl;实验组推入含有Si RNA的转染复合物8μl。上述操作后将NS组、MOCK组及Si RNA组大鼠以动脉瘤夹钳夹造成脊髓损伤。2.每组选取6只大鼠,记录术前、术后12h、24h、48h、72h、7d和14d七个时间点的BBB评分并记录统计。3.实验取材均在手术后72h进行,进行RNA、脊髓总蛋白提取及冰冻切片制作。4.qRT-PCR检测不同组间脊髓节段Miro1的基因表达情况(n=3);Western-Blot法检测不同组间Miro1的表达情况(n=3)。5.Western-Blot法检测驱动蛋白重链(Kinesin Heavy Chain,KHC),驱动蛋白轻链1(Kinesin Light Chain 1,KLC-1),动力蛋白中间链(Dynein Intermediate Chain,DIC),线粒体锚定蛋白(Syntaphilin,SNPH),凋亡相关基因蛋白BAX和B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,BCL-2)的表达情况。6.不同组间大鼠脊髓切片TUNEL染色观察凋亡情况(n=3)。结果:1.qRT-PCR及Western-Blot都提示在SCI后72h,Si RNA组Miro1的基因表达或蛋白表达量较MOCK组及NS组均下降。2.Si RNA组较MOCK组及NS组的KHC及SNPH表达明显下降,DIC及KLC-1无显著变化;Si RNA组的BAX表达增加,Bcl-2表达下降,BAX/Bcl-2增大。3.TUNEL染色:Si RNA组阳性细胞较MOCK组及NS组明显增多。4.BBB评分:SCI后Si RNA组的BBB评分(7d:6.5±0.45;14d:8.58±0.80)较MOCK的BBB评分(7d:7.67±0.75;14d:9.67±0.75)在7d和14d均有明显下降(7d:p<0.01;14d:p<0.05)。结论:Miro1通过与驱动蛋白(Kinesin)相结合和线粒体锚定蛋白(Syntaphilin)作用,参与调控的线粒体运动作用于脊髓损伤大鼠神经元的凋亡过程,并且在一定程度上保护神经元。且这一调控过程最可能是通过调节BAX/Bcl-2两种蛋白量的比例这一通路实现的。其中与驱动蛋白作用位点主要考虑为驱动蛋白重链(KHC)。第四部分慢病毒载体注射致Miro1过表达对改善脊髓损伤预后的探讨目的:1.利用慢病毒载体技术使Miro1在脊髓节段中过表达;2.观察并验证SCI后脊髓节段Miro1的表达量改变;3.观察神经元凋亡情况及脊髓功能的改变;4.进一步验证Miro1对SCI后神经元凋亡的影响机制。研究方法:1.依照Miro1基因(RHOT1)设计,对GV492-Miro1慢病毒载体进行构建与生产;2.将空载慢病毒(GV492)和过表达载体慢病毒(GV492-Miro1)调成1×10~9TU/ml的悬液。SD雄性大鼠6只(体重271-276g)并分成两组,在T10节段分别将8μl空载慢病毒悬液和Miro1过表达载体慢病毒悬液推入大鼠脊髓;术后第7天将两组大鼠处死及取材,制作冰冻切片,DAPI封片,共聚焦显微镜观察计数、统计。证实感染效率。3.60只雄性SD大鼠(体重278-287g)随机分成空白对照组(Sham)、生理盐水对照组(NS组)、空载慢病毒对照组(Lenti-Ctrl)和实验组(Lenti-Miro1)四组。各组大鼠进行两次手术:a.注射手术:NS组、Lenti-Ctrl组和Lenti-Miro1三组大鼠显露T10脊髓节段,分别缓慢将8μl生理盐水、空载慢病毒悬液和过表达载体慢病毒悬液推入脊髓T10。Sham组大鼠作为对照,仅暴露不注射,操作同第一部分实验Sham组大鼠相同。第一次术后大鼠饲养七天进行下一阶段。b.脊髓损伤手术:NS组、Lenti-Ctrl组和Lenti-Miro1三组大鼠再次显露T10脊髓节段并钳夹造模。Sham组大鼠接受二次手术作为对照,显露硬膜囊后暴露创面120s后缝合伤口。4.对四组大鼠均随机选取6只进行BBB评分,在第一次手术前和手术后的12h、24h、48h、72h、7d;第二次手术后的12h、24h、48h、72h、7d、14d观察大鼠的BBB评分。5.每组大鼠均在二次手术结束后72h处死进行取材,提取脊髓RNA或总蛋白。6.qRT-PCR检测不同组间Miro1的基因表达情况(n=3);Western-Blot检测不同组间Miro1的表达情况(n=3)。7.Western-Blot法测定KHC、KLC-1、DIC、SNPH、BAX和BCL-2的表达情况(n=3)。8.不同组间大鼠脊髓节段TUNEL染色观察凋亡情况(n=3)。结果:1.大鼠T10节段在注射空载慢病毒(GV492)和过表达载体慢病毒(GV492-Miro1)后7d,共聚焦显微镜下可检测到病毒转染阳性神经元细胞,且两组阳性细胞数无显著差异。2.qRT-PCR及Western-Blot均提示在SCI-72h,Lenti-Miro1组Miro1的基因表达或蛋白表达量较Lenti-Ctrl组及NS组均上升;3.Lenti-Miro1组较Lenti-Ctrl组的KHC及SNPH表达亦明显上升,DIC及KLC-1无显著变化;Lenti-Miro1组的BAX表达变化不明显,Bcl-2表达升高,BAX/Bcl-2下降。4.TUNEL染色:Lenti-Miro1组阳性细胞较Lenti-Ctrl组及NS组减少。5.BBB评分:Lenti-Miro1组的BBB评分(SCI术后7d:8±0.45;14d:11.75±1.17)及Lenti-Ctrl组评分(7d:7.67±0.75;14d:9.75±0.52),7d时两组差异不大(p>0.05);14d显著增高(p<0.01)。结论:慢病毒载体使得脊髓局部过表达Miro1可改善脊髓损伤神经元的凋亡情况,保护神经元功能。进一步证实了Mrio1在脊髓损伤中通过与Kinesin及Syntaphilin作用,调控线粒体转运,进而抑制神经元的凋亡而对神经元起到保护作用。慢病毒载体局部注射使脊髓过表达Miro1,为生物治疗改善脊髓损伤对脊髓功能的损害提供一定的理论基础。