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[背景与目的]胶质瘤是中枢神经系统中最常见的一种原发性肿瘤。高级别胶质瘤手术切除后联合放化疗预后仍不十分理想,且容易复发和耐药。因此,寻找与胶质瘤发生发展相关的关键分子,并针对其治疗胶质瘤十分必要。GSK3β是一种在进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶,在所有组织中都有表达,而在脑组织中的表达幅度尤为富集。GSK3β具有广泛的生物学作用,参与肿瘤相关的 Wnt/β-catenin、PI3K/AKT/mTOR、NF-κB、MAPK 等多个信号转导通路,与肿瘤细胞的生长、增殖及凋亡过程密切相关。自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡,与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹内容物的过程。研究发现,在口腔癌、乳腺癌和前列腺癌中,GSK3β可以通过调节细胞自噬从而影响细胞的生长、增殖及凋亡。然而GSK3β在胶质瘤细胞中对自噬的影响尚不清楚。因此,本课题通过过表达GSK3β,分别于体内和体外实验研究GSK3β基因对胶质瘤细胞自噬水平的影响及可能的作用机制,并进一步研究GSK3β诱导的细胞自噬对细胞功能的影响。[方法](1)运用过表达GSK3β、S9A-GSK-3β和Y216A-GSK-3β的慢病毒载体,转染U87和U251细胞,分别构建GSK3β、p-GSK-3β(Tyr 216,激活形式)和p-GSK-3β(Ser9,失活形式)高表达的细胞系。(2)采用免疫荧光技术、Western blot及电镜观察GSK3β过表达前后胶质瘤细胞中的自噬水平。(3)在分子水平上探讨GSK3β影响胶质瘤细胞自噬的分子机制,检测GSK3β下游与自噬调节密切相关基因的表达水平。(4)使用CCK-8试剂盒和流式细胞仪检测GSK3β引起的自噬对胶质瘤细胞功能的影响;采用平板克隆实验和CCK-8法检测GSK3β引起的自噬在胶质瘤细胞中对替莫唑胺敏感性的影响。(5)构建人胶质瘤异位移植瘤模型,在体内水平验证GSK3β引起的自噬在胶质瘤细胞中对替莫唑胺敏感性的影响,同时验证相关蛋白的表达变化。[结果](1)在过表达GSK3β的胶质瘤细胞株中,相比于GFP组和Ctrl组,GSK3β增加了胶质瘤细胞中的自噬流;过表达GSK3β会同时增加细胞中p-GSK-3β(Tyr 216,激活形式)和p-GSK-3β(Ser9,失活形式)的表达量。(2)过表达GSK3β诱导的自噬是由于p-GSK-3β(Ser9)的升高,而不是由于p-GSK-3β(Tyr 216)的升高。(3)在细胞水平探讨其分子机制:p-GSK-3β(Ser9)升高诱导自噬的同时也会引起p-AMPK(Thr172)和p-ULK1(Ser 555)的升高。使用shAMPKα沉默AMPKα后可以逆转p-GSK-3β(Ser9)升高诱导的自噬。表明AMPK-ULK1通路参与p-GSK-3β(Ser9)诱导自噬的过程。(4)在体外实验中,p-GSK-3β(Ser9)的升高并不影响胶质瘤细胞的凋亡、周期和增殖,但是增加了其对替莫唑胺的抵抗性。使用自噬抑制剂3-MA可以逆转对替莫唑胺的抵抗性。(5)在胶质瘤异位移植瘤组织中,Y216A+TMZ组与GFP+TMZ组相比,肿瘤体积明显增大,而Y216A+3-MA+TMZ组与Y216A+TMZ组相比,肿瘤体积明显减小;免疫组化结果显示Y216A组与GFP组相比,LC3Ⅱ的表达水平显著升高。[结论](1)p-GSK-3β(Ser9)的升高会导致胶质瘤细胞中的自噬水平升高,其可能的机制为p-GSK-3β(Ser9)的升高通过激活AMPK-ULK1通路诱导细胞自噬。(2)p-GSK-3β(Ser9)诱导的自噬是一种保护性自噬,可以导致胶质瘤细胞对替莫唑胺的耐药,并且可被自噬抑制剂3-MA逆转。本研究表明,胶质瘤组织中p-GSK-3β(Ser9)及其诱导的自噬作为胶质瘤治疗中的一个潜在作用靶点,为胶质瘤药物治疗的发展提供了新的研究思路。