研究背景《神农本草经》中记载“阴干曝干,……,真伪陈新,并各有法”,首次指出了药材在使用时有“陈”、“新”的区别。陶弘景在《本草经集注》中,首次提出了麻黄、陈皮、枳壳、半夏、狼毒、吴茱萸六味药材须“陈久者良”,即“六大陈药”,后被历代医家记载。20世纪90年代起,研究者开展了“陈久者良”这一理论的研究和讨论,但是文献报道较少,且目前尚未见从本草文献角度对这一理论进行系统考证的报道。此外,目前陈用药材在道地产区的实际生产情况如何亦未见文献报道。关于陈用药材的品质评价研究,以“六大陈药”的研究较多,其中又以陈皮的研究最多。国内外文献从陈皮的颜色、气味、挥发性成分、黄酮类成分、药理活性等方面进行了研究,但是存在研究品种不明确、研究内容不系统的问题。其他陈用药材的品质评价研究鲜有报道,且存在研究品种不明确、评价指标单一等问题。因此,本研究首先对“陈久者良”进行本草考证,选择陈皮、青皮和枳壳3味芸香科柑橘属药材为研究对象,开展道地产区实地调研以了解药材实际生产情况,并采用多种分析技术对3味药材的理化性质进行测定,开展品质评价研究。以期明确陈用药材的价值和机理,为中药材“陈久者良”的进一步研究奠定理论和数据基础。研究内容第一部分中药材“陈久者良”的本草考证和实地调研 通过网站、文献、古籍、电子书等形式,查阅历代本草文献书籍,按照唐以前及唐、宋金元时期、明代、清代本草的历史顺序,记录其中关于药材需要“陈久者良”、“久置”的记载,并汇总分析。根据本草文献考证的结果,选择了陈皮、青皮、枳壳等药材作为实地调研的主要对象,前往广东新会、江西樟树、河北安国、重庆等地进行实地调研,了解陈用药材生产现状。第二部分“陈久者良”药材的品质评价研究1多种分析技术对不同贮藏年份陈皮品质的多方位评价 收集12批次贮藏了 1～23年的陈皮作为实验样品。采用色差仪、电子鼻和电子舌3种电子感官技术评价色泽、气味和味道的变化。采用高效液相色谱法（HPLC）进行指纹图谱比较研究。采用基于超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱（ultra-performance liquid chromatography tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-QTOF-MS）的非靶向代谢组学结合多元统计分析方法测定并筛选差异化合物;采用HPLC法测定了其中3个活性成分橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的含量。同时,采用紫外分光光度法测定总酚和总黄酮的含量,并基于1,1-二苯基-2-（2,4,6-三硝基苯基）肼自由基清除法（1,1-diphenyl-2-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazine,DPPH）和铁离子抗氧化能力法（ferric-reducing antioxidantpotential,FRAP）对不同年份陈皮的抗氧化活性进行了评价。采用顶空固相微萃取气质联用技术（headspace solid-phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS）对挥发性成分的种类和相对含量进行测定。采用双变量相关性方法分析色、气、味的变化与化学成分的相关性。2不同贮藏年份青皮品质的动态评价 收集连续贮藏了 5年的青皮样品。采用色差仪和电子鼻对各年份青皮的色泽和气味进行测定。采用HPLC对3个主要成分橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的含量进行测定。采用紫外分光光度法测定总酚和总黄酮的含量。采用基于UPLC-QTOF-MS的非靶向代谢组学结合多元统计方法筛选差异化合物。采用HS-SPME-GC-MS对挥发性成分进行测定。采用DPPH和FRAP两种方法评价抗氧化活性。3不同贮藏环境和时间枳壳品质的动态评价 建立了低温中湿、常温常湿和高温高湿三种贮藏环境,于贮藏的第0、1、3、5、9个月取出适量样品对理化性质进行动态测定和分析。采用色差仪对枳壳的色泽变化进行测定。采用HPLC测定芸香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的含量。采用紫外分光光度法测定枳壳中总酚和总黄酮的含量。基于DPPH法和FRAP法测定了抗氧化活性。并采用单因素方差分析比较数据差异的显著性和双变量相关性方法分析数据的相关性。研究结果 第一部分中药材“陈久者良”的本草考证和实地调研 历代本草文献记载须“陈久者良”的药材达90味,包括“六大陈药”、艾叶、芫花、槐实、棕榈皮、木瓜、天南星等现代常用的药材,也包括酱、醋、芜荑、酒、曲等发酵类药材和发、金汁等目前已不常用的药材。明代《本草纲目》以条目记载的数量最多,达到29种。清代《本草从新》的药性总义中,集中记载了近40味陈用药材。陈用的原因有去除或减弱毒副作用、增强功效或者选择功效等。实地调研结果发现广东新会产陈皮和青皮在采收干燥后须在当地贮藏3年以上。贮藏库主要有大型规模化贮藏库、普通贮藏库、农户家庭小仓库等多种类型。在江西樟树、重庆江津等枳壳的道地产区,枳壳采收干燥后便出售,在产地不进行长时间贮藏。造成这种现象的原因可能是产区生产者观念淡薄,不知“陈久者良”的传统观点;贮藏过程中的变色和虫蛀现象,阻碍了枳壳的贮藏;需求量大使得枳壳成为快销品,采收经产地干燥后便出售;缺乏现代研究。第二部分“陈久者良”药材的品质评价1多种分析技术对不同贮藏年份陈皮品质的多方位评价 贮藏年份为1～2年陈皮的色泽呈橙黄色,随着贮藏年份延长,色泽逐渐加深为褐色。体现在色泽参数上为L*（明亮度）、b*（黄蓝色轴）和c*（彩度）值的降低和ΔE*值的升高,明确了不同年份陈皮色泽加深体现在色泽参数数值上的变化。气味的变化不明显。水溶液主要表现为苦味、鲜味和甜味3种味道,且随着贮藏时间的延长,苦味增加。基于HPLC的指纹图谱结果显示,不同贮藏年份陈皮中共标定出14个共有峰,对共有峰峰面积相似度进行计算和聚类分析,认为贮藏了 1～2年陈皮与贮藏了 3～23年陈皮被分为两类。基于UPLC-QTOF-MS非靶向代谢组学技术结合多元统计分析方法包括主成分分析（principal component analysis,PCA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA）的结果认为 PCA 和 OPLS-DA 均可以较好的区分贮藏了 1～2年和3～23年的陈皮样品。结合OPLS-DA中变量投影重要度（Variable Importance for the Projection,VIP）值、S-plot 图、以及 ANOVA p 值和最大差异倍数,筛选差异化合物,共筛选出26个差异离子,鉴定了 9个化合物。在贮藏1～2年陈皮中,黄樟醇6,8-二-C-葡萄糖苷、谷氨酸、5-甲基尿苷、picraquassioside A和柠檬苦素5个化合物的含量较贮藏了 3～23年陈皮中的含量显著降低,野漆树苷、橙皮素、单羟基-五甲氧基黄酮和单羟基-四甲氧基黄酮4个化合物的含量显著升高。HPLC法对不同年份陈皮中橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的含量测定结果显示,不同年份陈皮中橙皮苷的含量随着贮藏年份的延长,呈先升高后降低的变化。川陈皮素和橘皮素的含量在贮藏1～14年呈波动升高,随后逐渐降低。总酚的含量随着贮藏时间的延长,呈波动降低的变化;总黄酮的含量在贮藏的1～14年整呈波动变化,在17～23年陈皮中明显降低。基于DPPH和FRAP的抗氧化结果显示,陈皮在贮藏到第14年时,抗氧化能力出现降低,且与陈皮中总酚和总黄酮的含量的变化相关。HS-SPME-GC-MS的结果显示,随着贮藏年份的延长,陈皮中2-丁氧乙酸丁酯、3-甲基-4-异丙基苯酚、2-甲氨基-苯甲酸甲酯和3,7,11-三甲基-（Z,E）-1,3,6,10-十二碳四烯的相对含量波动下降。1-甲基-3-（1-甲基乙烯基）-苯、顺式-2-甲基-5-（1-甲乙基）-2-环己烯-1-醇、D-香芹酮和（S）-3-甲基-6-（1-甲乙基）-2-环己烯-1-酮的含量波动升高。芳香类化合物在贮藏的第14年以及之后明显降低。相关性分析结果认为色泽、气味和味道的变化与内部成分的变化有关。2不同贮藏年份青皮品质的动态评价 青皮在贮藏过程中色泽从深绿色逐渐加深为深褐色,体现在色泽参数上的变化为L*、b*、c*和h*值均显著降低,ΔE*值则显著升高。HPLC测定的不同贮藏年份青皮中橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的含量随着贮藏年份延长均显著降低。总酚和总黄酮的含量随着贮藏年份延长显著降低,抗氧化活性显著减弱。且在贮藏了3～5年青皮中各检测指标的含量均较贮藏了 1～2年青皮的含量显著降低。非靶向代谢组学结合多元统计方法偏最小二乘判别分析（partial least squares discrimination analysis,PLS-DA）共筛选出21个差异离子,鉴定了其中9个化合物分别为:芸香柚皮苷、香叶木素6,8-二-C-葡萄糖苷、Melitidin、Picraquassioside A、5-甲基尿苷、谷氨酸、鼠李素-3-O-葡萄糖苷、三羟基-二甲氧基黄酮和香叶木素,其中芸香柚皮苷、香叶木素、香叶木素6,8-二-C-葡萄糖苷和鼠李素-3-O-葡萄糖苷4个化合物的含量,在贮藏到4～5年青皮中含量显著升高,推测为青皮“陈久者良”的物质基础。而5-甲基尿苷和谷氨酸的含量随着贮藏年份的延长逐渐降低。HS-SPME-GC-MS的结果显示,随着贮藏年份延长,青皮中2-丁氧乙酸丁酯的相对含量在逐渐下降。酯类成分逐渐降低;烯烃类和烷烃类成分逐渐升高。最后,双变量相关性分析结果显示,色泽和气味的变化受内部成分变化的影响。3不同贮藏环境和时间枳壳品质的动态评价 枳壳在低温中湿环境下,柚皮苷和新橙皮苷的含量在0～3月升高随后保持稳定。芸香柚皮苷、川陈皮素和橘皮素的含量在0和1月保持稳定,在3～9月明显升高。总酚的含量逐渐降低。总黄酮的含量则逐渐升高。DPPH和FRAP法测得的抗氧化值逐渐升高。在常温常湿环境下,柚皮苷、新橙皮苷的含量在贮藏的0～3个月逐渐升高,随后保持稳定。芸香柚皮苷的含量无显著变化。川陈皮素的含量逐渐升高。橘皮素的含量在0～3月保持稳定,5～9月显著升高。总酚的含量逐渐降低。总黄酮的含量则逐渐升高。DPPH和FRAP法的抗氧化逐渐升高。在高温高湿环境下,柚皮苷和新橙皮苷的含量在0～3月显著升高后保持稳定;芸香柚皮苷的含量在0～1月保持稳定,在3～9月显著升高;川陈皮素和橘皮素和含量在0～3月保持稳定,5～9月显著升高。总酚的含量逐渐降低。总黄酮的含量呈升高的变化。DPPH和FRAP法的抗氧化值均升高,且较其他两种贮藏环境相应时间升高的多。色泽在高温高湿环境下由黄绿色加深为黄褐色,在其他两种贮藏环境下变化不大,色泽参数与化学成分的含量呈现显著相关。研究结论历代医家均有记载陈用中药材,除了“六大陈药”,还有近90种药材需要陈用。药材实际生产中,陈皮、艾叶等遵循了“陈久者良”的观点,在产地进行贮藏。大部分药材,本草文献记载需要陈用,但实际生产中已经不进行长时间贮藏。不同贮藏年份陈皮,随着贮藏年份的延长,色泽由橙黄色加深为褐色。高效液相指纹图谱技术可以区分贮藏1～2年和3年及以上陈皮。在不同贮藏年份陈皮中鉴定了9个差异化合物,可以作为不同贮藏年份陈皮的标志物。橙皮苷、川陈皮素、橘皮素、总酚和总黄酮的含量均出现升高或者降低的变化、抗氧化活性受总酚和总黄酮含量的影响。综合检测结果,认为陈皮有必要进行贮藏,其“陈久者良”的物质基础可能是野漆树苷、橙皮素、川陈皮素和橘皮素等多甲氧基黄铜、总黄酮的含量和D-香芹酮等挥发性成分。此外,结合各检测指标的变化趋势,认为陈皮的贮藏年份不是越长越好,建议贮藏时间为3～14年。芸香柚皮苷、香叶木素、香叶木素6,8-二-C-葡萄糖苷和鼠李素-3-O-葡萄糖苷可能是青皮“陈久者良”的物质基础。而主要成分（橙皮苷、川陈皮素和橘皮素）的含量从贮藏第三年开始显著降低。因此认为青皮有“陈久者良”的物质基础,但是否需要贮藏需要进一步深入研究。首次建立了低温中湿、常温常湿、高温高湿3种环境贮藏枳壳并进行品质评价,认为枳壳在贮藏过程中,发生了陈化作用,主要黄酮类成分的含量升高,质量有所提高,且适当高的温度和湿度有利于枳壳的陈化。该研究印证了古人关于枳壳“陈久者良”的传统观点。陈皮、青皮和枳壳均为芸香科柑橘属药材,均被记载需要陈用。在贮藏过程中,3味药材的颜色均加深为褐色或深褐色;抗氧化活性的变化均与其中黄酮类成分的含量变化有关;药材中含量升高的成分均为黄酮类。认为黄酮类成分是3味药材“陈久者良”的主要物质基础。建议青皮和枳壳适当贮藏一定时间后再使用。