酶法制备卡拉胶寡糖及其生物活性与应用研究

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卡拉胶(Carrageenan)是由β-1,3-D-半乳糖和α-1,4-D-半乳糖为基本构架交替连接形成的一种亲水性硫酸海藻多糖,主要从海藻细胞壁中提取得到。根据是否含有3,6-内醚半乳糖及硫酸根含量的不同,工业上主要将卡拉胶分为κ-、ι-、λ-三种类型。卡拉胶寡糖是卡拉胶降解后得到的低聚糖,具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、抑制血管生成等广泛的生物活性,在功能性食品和医药行业具有极大的开发应用潜能。本实验室前期筛选获得一株产κ-卡拉胶酶的菌株Pseudoalteromonas sp.ASY5,在此基础上,利用菌株发酵获得粗酶液,对酶解工艺进行优化,从而制备得到不同平均聚合度的卡拉胶寡糖,进而,对制备得到的卡拉胶寡糖生物活性进行研究。主要研究结果如下:首先,以κ-卡拉胶为底物,采用酶法制备卡拉胶低聚糖,以总糖含量和还原糖生成量为评价指标,对酶解条件进行优化,并采用薄层色谱和质谱对酶解产物进行初步分析。结果显示酶解反应最优工艺条件为:底物浓度12 g/L、pH 7.0、反应温度40℃、振荡速率100 rpm,经优化后的酶解反应更完全,还原糖生成量由开始的0.91 mg/mL提高至1.61mg/mL,得率调高了77%,酶解卡拉胶反应的Km值为171.96 mg/mL,最大反应速度Vmax为0.925 mg·mL-1·min-1。最优工艺验证试验和20 L放大实验结果基本一致,经薄层层析结果与质谱结果分析终产物主要为κ-卡拉胶二糖。继而,以麒麟菜粗多糖(主要成分为卡拉胶)与精制卡拉胶为原料,酶解制备得到不同平均聚合度的6种寡糖,再对寡糖体外抗氧化活性和抑菌活性进行考察。6种寡糖在一定浓度范围内均呈现出抗氧化能力,其中寡糖浓度与ABTS自由基清除率和Fe2+螯合能力呈现出良好的线性关系;对DPPH、OH、ABTS自由基的清除都是平均聚合度越低清除效果越好,对Fe2+的螯合以平均聚合度为8的寡糖螯合能力最强;在同浓度情况下,麒麟菜寡糖可达到与卡拉胶寡糖近似的抗氧化活性。6种寡糖在30 mg/mL浓度处理条件下对5种受试菌未呈现出抑制效果。最后,先将6种寡糖分别浸泡处理罗非鱼鱼肉,以感官评分、硫代巴比妥酸值(TBA值)、鱼肉pH为考察指标,初选出平均聚合度为6的卡拉胶寡糖(PD-6)对罗非鱼保鲜效果最好,并且平均聚合度越低,保鲜效果越好。再以浓度为0-10 mg/mL的PD-6浸泡处理罗非鱼,以感官评分、pH、酸价、TBA值、TVB-N值、菌落总数这六项指标,优选出PD-6寡糖最优处理浓度3 mg/mL,并将罗非鱼肉冷藏保鲜货架期延长了1-2 d。
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