研究背景:乳酸对于肿瘤细胞的生存和肿瘤诊治意义重大,是肿瘤代谢领域的研究热点之一,有报道指出乳酸根离子和氢离子共同作用可以帮助肿瘤细胞在葡萄糖缺乏的环境中生存。应用这一原理,对肝细胞癌患者施行肝动脉化疗栓塞,将碳酸氢钠局部灌注到肿瘤中,疗效良好,显著提高了患者生存期。许多研究关注乳酸对肿瘤细胞的作用以及在不同条件下乳酸的生成量。目前认为乳酸可以由葡萄糖或谷氨酰胺生成,但两种来源的比例还不清楚。另外,葡萄糖可以经糖酵解直接生成乳酸,也可以经磷酸戊糖途径后回到糖酵解生成乳酸,但这两种路径生成的乳酸各占乳酸总量的百分之多少还不清楚。本文的初衷是采用基于LC-MS/MS检测的13C标记追踪法研究乳酸的来源分布和生成途径分布情况,却意外发现13C会影响13C标记乳酸的质谱行为,到现在为止这一现象还未见报道,而基于质谱检测的13C追踪法在代谢研究领域应用得非常广泛,因此这一发现具有较大的理论意义,且对基于质谱检测的13C追踪法的应用也具有指导作用。研究方法:为了探索细胞内乳酸的来源分布和生成途径分布情况,本文分别用[U-13C]-、[1,2-13C2]-、[3-13C]-、[1-13C]-、[1,2,3-13C3]-、[4-13C]-和[6-13C]葡萄糖孵育细胞,用LC-MS/MS检测培养液中的乳酸和各类13C标记乳酸。因意外发现13C可能会影响13C标记乳酸的质谱行为,故用LC-MS和LC-MS/MS检测以下标准品:乳酸、[1-13C]乳酸、[3-13C]乳酸、[2,3-13C2]乳酸和[U-13C]乳酸,并用DFT法计算乳酸和各类13C标记乳酸碎裂途径中间产物的活化能。另外,为了单纯研究葡萄糖经糖酵解生成的乳酸,本文在体外建立无细胞糖酵解反应体系,分别以[1-13C]-、[3-13C]-、[4-13C]-、[6-13C]-、[1,2-13C2]-和[1,2,3-13C3]葡萄糖为底物,用LC-MS/MS检测生成的乳酸和各类13C标记乳酸。最后,为了探索13C对13C标记化合物质谱行为的影响是否具有普遍性,本文用LC-MS和LC-MS/MS检测以下标准品:葡萄糖、[U-13C]葡萄糖、谷氨酰胺和[U-13C]谷氨酰胺。研究结果:1.用基于LC-MS/MS的13C追踪法测定乳酸和各类13C标记乳酸的百分比,并计算乳酸的来源分布和生成途径分布情况1)用[U-13C]葡萄糖孵育细胞,发现肿瘤细胞中由葡萄糖、其他来源以及混合来源生成的乳酸分别占97%、2%、1%。正常T细胞中结果略有差异,以上三种来源生成的乳酸分别占:90%、8%和2%。2)用[1,2-13C2]葡萄糖孵育细胞,发现在肿瘤细胞中经糖酵解生成的乳酸占90%、经磷酸戊糖途径后返回糖酵解生成的乳酸占6.6%、经其他途径生成的乳酸占2.2%。正常T细胞中结果略有差异:经以上三种途径生成的乳酸分别占85%、6.0%和 7.9%。3)用[3-13C]葡萄糖孵育细胞,发现在肿瘤细胞中经糖酵解生成的乳酸占89%、经磷酸戊糖途径后返回糖酵解生成的乳酸占9.2%、经其他途径生成的乳酸占2.2%。正常T细胞中结果略有差异:经以上三种途径生成的乳酸分别占84%、8.1%和 7.9%。4)葡萄糖经糖酵解,1,2,3位碳原子生成的乳酸与4,5,6位碳原子生成的乳酸应当等量,[3-13C]葡萄糖组的结果符合理论,但[1,2-13C2]葡萄糖组的结果不符合。为进一步探索葡萄糖1,2,3位碳原子和4,5,6位碳原子经糖酵解生成的乳酸是否等量,分别用[1-13C]-、[6-13C]-、[1,2,3-13C3]-和[4-13C]标记葡萄糖孵育细胞,结果显示,经糖酵解由葡萄糖1,2,3位碳原子生成的乳酸与4,5,6位碳原子生成的乳酸的比值不一致,最小为0.85([6-13C]葡萄糖),最大为1.6([1,2,3-13C3]葡萄糖)。2.证实13C影响13C标记乳酸的质谱行为,并提出基于质谱检测的13C追踪实验结果需要校正。乳酸标准品分别与各类13C标记乳酸标准品([2,3-13C2]-、[3-13C]-、[U-13C]-和[1-13C]乳酸)混合,并分别用LC-MS和LC-MS/MS检测各混合液,发现13C显著影响13C标记乳酸的碎裂效率,而对离子化效率影响不大。将前文13C标记葡萄糖([U-13C]-、[1,2-13C2]-、[3-13C]-、[1-13C]-、[6-13C]-、[1,2,3-13C3]-和[4-13C]葡萄糖)孵育细胞的结果进行校正,并重新计算乳酸的来源分布和生成途径分布。校正后,所有结果均符合理论。3.计算乳酸碎裂过程中间产物的活化能,并与实验结果对比,提出一个理论悖论经理论计算,乳酸碎裂过程中过渡态2(丢CO)是乳酸碎裂的限速步骤。乳酸过渡态2的活化能小于或等于各类13C标记乳酸,由此推论乳酸丢CO的效率等于或大于各类13C标记乳酸,这与前文标准品实验结果相反,故由此得出一个悖论。4.体外无细胞糖酵解系统中,13C标记葡萄糖经糖酵解1,2,3位碳原子与4,5,6位碳原子生成的乳酸不等,且二者比值与葡萄糖地13C标记位置有关。分别用[1,2-13C2]-、[1,2,3-13C3]-、[1-13C]-、[3-13C]-、[4-13C]-和[6-13C]葡萄糖作为体外无细胞糖酵解系统的底物,用LC-MS/MS检测生成的乳酸和13C标记乳酸,校正后,结果显示若底物的13C标记在1,2,3位碳原子([1,2-13C2]-、[1,2,3-13C3]-、[1-13C]-、[3-13C]葡萄糖),由葡萄糖1,2,3位碳原子生成的乳酸与4,5,6位碳原子生成的乳酸的比值是0.64;若底物的13C标记在4,5,6位碳原子([4-13C]-、[6-13C]葡萄糖),葡萄糖1,2,3位碳原子生成的乳酸与4,5,6位碳原子生成的乳酸的比值是0.8,理论上不论13C标记在什么位置,二者比例都应当是1,但实验结果与理论不符,且具有规律性,其原因还未明确,需要设计其他实验进一步研究。5.13C标记影响葡萄糖和谷氨酰胺的质谱行为用LC-MS和LC-MS/MS分别检测葡萄糖标准品和[U-13C]葡萄糖标准品的等浓度混合液以及谷氨酰胺标准品和[U-13C]谷氨酰胺标准品的等浓度混合液,发现13C对[U-13C]葡萄糖和[U-13C]谷氨酰胺的碎裂效率均有影响,可见13C对13C标记化合物质谱行为的影响具有普遍影响。结论:1)本文首次系统地阐明肿瘤细胞4T1、Hela、K562和小鼠胸腺细胞乳酸的来源分布和生成途径分布。2)本文首次发现13C显著影响了13 标记乳酸在质谱中的离子化过程和碎裂效率,并发现13C标记对[U-13C]葡萄糖和[U-13C]谷氨酰胺的碎裂效率也有显著影响,说明13C对13C标记化合物质谱行为的影响具有普遍性。3)对乳酸分子碎裂过程的中间产物进行理论计算,发现实验数据与理论计算结果相悖,由此提出一个理论悖论,有待量子物理学家和量子化学家进一步解析。4)本文提示过去许多基于MS/MS检测的13C标记追踪研究的实验结果可能存在较大偏差,今后进行此类实验需要使用相应标准品进行校正。