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背景:慢性感染、严重的车祸创伤、恶性肿瘤等常常造成的大范围的难以愈合的骨缺损是临床上骨缺损修复的一大难题。自体骨移植、异体骨移植、人工合成材料等修复方式存在供骨区创伤大、供区新缺损、供体骨有限、免疫排斥、传播感染性疾病及花费高昂高等缺点。因此研究者们将目光投向组织工程技术,探讨将组织工程技术与基因治疗技术结合,期望找到安全有效的载体携载基因以便在体内高效率地表达目的基因进行骨缺损修复的治疗。研究表明,壳聚糖(CS)因其具有良好的生物相容性和低细胞毒性可以作为基因载体,而且壳聚糖经过化学方法添加烷基、巯基或羟丁基等形成的改性壳聚糖如羟丁基壳聚糖(HBC)和巯基烷基化壳聚糖(TACS)经纳米工艺制成纳米结构后可作为缓释基因载体用于基因治疗。骨形成蛋白4(BMP4)可诱导骨髓间充质干细胞成骨分化,促进新生骨的形成,碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)可促进新生血管形成,在骨缺损修复过程中发挥重要作用。因此本研究拟探讨改性壳聚糖分别包裹BMP4基因和FGF2基因后在体外的生物学作用及应用于兔桡骨临界骨缺损修复的作用。目的:本研究将巯基烷基化聚糖分别与pFGF2基因和pBMP4基因混合制成具有转染特性的微球,然后再在微球外包裹同质量的羟丁基壳聚糖制成双层结构的缓释基因载体。探讨改性壳聚糖基因载体携载pBMP4基因和pFGF2基因共同作用骨缺损修复提供新的策略。方法:用PBS缓冲液将巯基烷基化壳聚糖(TACS)溶解后分别与pFGF2基因质粒和pBMP4基因质粒按照比例混合。基因通正负电荷作用形成拥有TACS外壳的结构,即TACS-pFGF2和TACS-pBMP4),再将与TACS同质量的HBC与核结构混合,形成以基因为核心的双层外壳结构,及HBC@TACS-pFGF2和HBC@TACS-pBMP4缓释微球。缓释微球在体外与骨髓间充质干细胞共培养,免疫蛋白印迹分析基因载体转染细胞后表达目的蛋白的情况。CCK8检测不同剂量的基因载体的细胞毒性。PCR检测不同基因载体与骨髓间充质干细胞共培养后相关成骨基因mRNA的表达情况。在兔双侧桡骨手术造成长约18mm的桡骨缺损,并以此编号随机分成6组。将含有不同剂量pBMP4基因质粒和pFGF2基因质粒的基因载体的溶液加入到明胶海绵(18mm*20m)中冻干后卷成长约18mm的圆柱状填充到骨缺损部位(实验组A:100ug pBMP4+40ug pFGF2,实验组 B:100ug pBMP4+20ug pFGF2,实验组 C:100ug pBMP4+10ug pFGF2实验组D:100ug pBMP4,E组:移植入卷成柱状的明胶海绵,正常桡骨组F:不做手术保留完整桡骨),第8周、第12周,第16周时分别进行X线扫描评价骨缺损修复情况,取大体标本,观察骨缺损修复情况、Masson染色以及生物力学检测等评价新生骨的生物学特性。结果:Western blot显示HBC@TACS-pFGF2和HBC@TACS-pFGF2和HBC@TACS-pBMP4可成功转染骨髓间充质干细胞并表达FGF2蛋白和BMP4蛋白,而且蛋白的表达量与时间呈正相关。细胞毒性实验表明在pBMP4质粒浓度时细胞增殖率为(149.26±0.76)%;pFGF2质粒终浓度为100ug/ml时细胞增殖率为(133.9±2.38)。骨髓间充质干细胞与pBMP4质粒终浓度为100ug/ml的HBC@TACS-pBMP4和FGF2质粒终浓度为40ug/ml TACS@HBC-pFGF2共培养后其成骨相关基因骨钙素(OCG)mRNA表达量较其他组高,且差异具有统计学意义。动物实验组中X线检查和大体标本观察均表明在骨缺损修复过程中加入pBMP4质粒终浓度为100ug/ml的HBC@TACS-pBMP4和FGF2质粒终浓度为40ug/ml TACS@HBC-pFGF2后16周兔桡骨骨缺损部位可以达到良好的修复,且骨髓腔再通。生物力学实验提示第16周时A组修复后的桡骨可承受的最大侧方应力为158.31N,达到正常桡骨可承受的侧方应力的93.73。且无统计学差异。Masson染色:在各个时间点,A组的新生骨矿化程度均高于其他组。结论:HBC和TACS可包裹pBMP4质粒和pFGF2质粒形成基因载体微球并且成功转染细胞表达BMP4蛋白和FGF2蛋白。在体外环境中加入适量微球能够促进BMSCs增殖并表达成功相关基因。在体内加入合适剂量的微球可以促进兔桡骨临界骨缺损的修复。