研究背景和目的:　　 慢性肝损伤引起肝纤维化,最终导致肝硬化甚至肝癌,已成为世界范围内的一类重大疾病。肝纤维化十分复杂的病理过程,其本质是肝星状细胞(hepaticstellate cells,HSCs)的活化和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的过度沉积。国内外的研究均证明肝纤维化是可以逆转的,有效的治疗肝纤维化可以防止各种慢性肝病向肝硬化发展。正常情况下肝星状细胞处于静止状态,当致肝病因子造成肝细胞损伤时,经多种信号转导途径使肝星状细胞激活,并转化为肌成纤维细胞,即导致HSC的活化。活化的HSC的主要特征包括HSC增殖和HSC内α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达。因此,研究肝纤维化的发生机制,有效阻止HSC的增殖和活化是治疗和逆转肝纤维化的重大课题。　　 Wnt信号转导通路是一种对细胞增殖和分化等多种功能具有重要调节作用的信号转导系统,涉及到胚胎生长,组织细胞增殖,维持内环境稳态等多种生命活动过程,是一个由多种分子参与、互相影响互相制约的复杂体系。目前,Wnt信号转导通路异常与肿瘤及多种人类疾病的发生发展相关,成为分子生物学、细胞生物学和肿瘤研究的热点。研究证实的Wnt信号转导通路有4条,分别为:经典的Wnt信号转导通路(又称为Wnt/β-catenin通路);Wnt/Ca2+通路;平面的细胞极性通路(Planar cell polarity pathway,PCP)又称Wnt/JNK通路;调节纺锤体定向和不对称细胞分裂的通路。其中Wnt/β-catenin信号转导通路是目前研究比较多、比较深入的一条分支。　　 近年来,肝纤维化的治疗并没有取得显著进展,西药由于抗纤维化作用靶位单一,疗效并不理想,而且有些药物的毒副作用大于治疗作用,不宜用于临床,因此,中医药抗肝纤维化治疗研究现正受到世界肝病学界的广泛重视。大量的临床试验和动物模型已证实中药肝复康具有改善肝功、减轻炎症、抑制纤维增生等功能,但其具体治疗机制仍需进一步探讨。　　 本课题采用CCL4诱导大鼠肝纤维化的动物模型,培养肝星状细胞HSC-T6,观察:1)中药肝复康对肝纤维化大鼠肝脏组织形态学及细胞外基质相关基因表达的影响;2)经典的Wnt/β-catenin信号转导通路在肝纤维化动物模型中的作用及中药肝复康对它的影响;3)中药肝复康药物血清对肝星状细胞HSC-T6中经典的Wnt/β-catenin信号转导通路的干预作用。　　 方法:　　 健康的SD大鼠(雌雄不限),体重180-220克,清洁级,由大连医科大学动物实验中心提供。正常喂养一周后,随机分为正常对照组(C),模型组(M),低剂量治疗组(LT)、中剂量治疗组(MT)、高剂量治疗组(HT)。除正常对照组外,余鼠造模。皮下注射以橄榄油稀释的10％的四氯化碳,5ml/kg,每周两次,共12周,正常对照组以同样方法皮下注射生理盐水。高、中、低剂量治疗组则于造模第9周后开始分别以3125mg/kg·d、312.5mg/kg·d、31.25mg/kg·d剂量的肝复康灌胃至20周。以上各剂量药物均溶于10ml/kg的生理盐水中。于12周末处死模型组,第20周末处死其他各组,取肝组织称取肝脏湿重,从肝右叶的中部切取2块肝组织,一块用10%的甲醛固定后制备石蜡切片,另一块于-70℃冰箱保存用于分子生物学检测。HE染色来反映肝纤维化的程度,双盲发采用Isak评分系统对肝纤维化程度进行评分。　　 大鼠肝星状细胞(HSC-T6)细胞株由上海中医药大学肝病研究所徐列明教授惠赠,中剂量药物血清依照既定工艺制备。　　 免疫组化法观察大鼠肝组织中TIMP-1,Tcf-4,α-SMA和β-catenin的表达;反转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测大鼠肝组织和肝星状细胞中Wnt1,Wnt3a,Wnt10b,Frizzled-1,Frizzled-2,GSK-3B,β-catenin,Tcf-4,CyclinD1,PPARγ,α-SMA,CollagenⅠ,CollagenⅢ,MMP2,TIMP-1的表达水平。免疫蛋白印迹(Western-Blot)方法检测β-catenin,Tcf-4,α-SMA,CollagenⅠ,TIMP-1在大鼠肝组织和肝星状细胞中的表达。实验结果均以均数±标准差((-x)±s)表示,采用SPSS统计软件,组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),然后用LSD法进行两两比较。用Pearson方法进行相关分析。P＜0.05为差异有意义,P＜0.01为差异有显著性意义。　　 实验结果如下:　　 一、中药肝复康对肝纤维化大鼠肝脏组织形态学及细胞外基质相关基因表达的影响　　 1.HE肝脏组织病理学染色结果显示:与正常组肝组织相比,模型组大鼠可见肝小叶结构紊乱,大量纤维组织增生,假小叶形成,肝细胞肿大,脂肪变性明显,部分有坏死;与模型组相比,肝复康高、中、低剂量治疗组大鼠肝小叶结构明显改善,肝细胞水肿好转,脂肪变性明显改善,胶原纤维增生明显减轻,其中中剂量治疗组(312.5mg/kg/d)治疗效果明显优于其它两组。　　 2.中药肝复康对细胞外基质相关基因表达的影响　　 免疫组化结果显示,正常组α-SMA和TIMP-1表达量很少;模型组肝组织可见大量的α-SMA和TIMP-1阳性染色;与模型组相比,肝复康高、中、低剂量治疗组阳性表达明显减少,其中中剂量治疗组效果最佳。　　 Western-Blot结果显示α-SMA,CollagenⅠ,TIMP-1在正常组表达很少或几乎不表达,模型组三者的表达明显高于正常组(p＜0.01),肝复康治疗组三者表达均明显下调。　　 RT-PCR结果显示,与正常组相比,CCL4刺激的模型组α-SMA,CollagenⅠ,CollagenⅢ。MMP2,TIMP-1mRNA表达水平显著增加(p＜0.01);与模型组相比,肝复康治疗组这些基因的表达均下调,以中剂量治疗组下调最为明显。　　 二、经典的Wnt/β-catenin信号转导通路在肝纤维化动物模型中的作用及中药肝复康对它的影响　　 1.经典Wnt信号通路中的Wnt配体Wnt1,Wnt3a,Wnt10b在CCL4刺激的模型组表达明显高于正常组(p＜0.05),肝复康干预可以缓解上述变化;Wnt受体Frizzled-1,Frizzled-2也具有类似的变化。　　 2.免疫组化和RT-PCR结果显示,经典Wnt信号通路中β-catenin和转录因子TCF-4在模型组中的表达明显高于正常组,肝复康治疗可以下调β-catenin的表达;而GSK-3β则表现为相反的结果。　　 Western-Blot结果显示,正常组细胞核内几乎不表达β-catenin,而模型组β-catenin在胞浆和胞核均发生明显的积累。　　 3.经典Wnt信号通路下游的靶基因CyclinD1在模型组的表达均高于正常组(p＜0.05),使用肝复康治疗后,二者表达明显减弱;PPARγ呈现相反的趋势。　　 4.经典Wnt信号通路中的关键因子与细胞外基质相关基因表达的相关性分析显示二者呈显著正相关。　　 三、中药肝复康药物血清对肝星状细胞HSC-T6中经典的Wnt/β-catenin信号转导通路的干预作用。　　 1.与正常组相比,乙醛刺激的模型组HSC细胞α-SMA,CollagenⅠ,CollagenⅢ,MMP2和TIMP-1的表达明显升高,用肝复康中剂量药物血清干预后,这些基因的表达显著下降。　　 2.经典Wnt信号通路的主要组分Wnt1,Wnt3a,Wnt10b,Frizzled-1,Frizzled-2,β-catenin和TCF-4在模型组的表达均明显上调,而GSK-3β的表达则降低,使用肝复康中剂量药物血清干预后,能明显改善上述变化。　　 3.经典Wnt信号通路下游的靶基因CyclinD1在模型组的表达均高于正常组,使用肝复康中剂量药物血清干预后,二者表达明显减弱;PPARγ则呈现相反的变化趋势。　　 4.经典Wnt信号通路中的关键因子与细胞外基质相关基因表达的相关性分析显示二者呈显著正相关。　　 结论:　　 1.肝复康中剂量治疗组能显著降低CCl4诱导的大鼠肝纤维化的程度,显著降低肝星状细胞HSC的活化,对肝纤维化有良好的治疗作用。　　 2.经典的Wnt/β-catenin信号转导通路参与了肝纤维化的发生和发展过程。　　 3.肝复康可能通过抑制经典Wnt信号转导通路的活化来达到改善肝功能、减轻肝损伤的目的。