【研究背景】心血管疾病是导致绝经后女性死亡的主要原因。长期以来,大量临床随机对照研究和基础研究工作均表明:激素替代疗法可有效降低绝经后女性心血管疾病的风险。然而,目前对雌激素替代治疗(estrogen re Placement thera Py,ERT)的心血管保护作用仍有争议,其主要原因是妇女健康倡议(Women’s Health Initiative,WHI)的早期研究结果发现:ERT增加深静脉血栓、脑卒中及子宫内膜癌等的发病率。这一结果引发全球范围内学术界的争议和讨论。随后对WHI结果进一步分析显示:ERT可降低处于“机会窗”的绝经后妇女(年龄<60岁)冠状动脉粥样硬化性心脏病的发病率。与此相应,2012年,丹麦骨质疏松症预防研究(DOPS)结果表明:对于近期绝经(2年之内)的女性,接受ERT 10年可明显降低死亡、心肌梗死或心力衰竭的复合终点事件(HR=0.61)。2016年《The New England Journal of Medicine》报道了ELITE(Early versus Late Intervention Trial with Estradiol)临床试验结果:ERT可明显减缓绝经少于6年的妇女颈动脉内膜中层增厚,而对绝经超过10年的妇女失去此保护效应。因此,进一步深入研究雌激素在心血管系统中的效应,并揭示其新的分子靶点和作用机制,将为ERT合理应用于预防绝经后妇女心血管疾病提供理论和实验依据。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的病理生理过程包括内皮细胞功能失调、平滑肌细胞增生、脂质斑块形成等一系列病变,其中,血管内皮细胞功能失调(endothelial dysfunction)是动脉粥样硬化发生的初始环节。内皮功能失调主要表现为内皮依赖性血管舒张功能减弱、抗凝功能受损、内皮形态不良、增殖、迁移能力受损、与白细胞、血小板粘附增多等。在这些病理生理改变过程中,内皮的增殖和迁移功能受损,可导致受损内皮不能得到及时修复,血管重新内皮化受阻,加速AS发生发展进程。近年来对雌激素抗动脉粥样硬化的研究,主要集中于探讨其对血管内皮功能的调控效应及其分子机制。国内外研究表明,雌激素可逆转内皮功能失调。在这一方面,我们课题组前期工作证实,处于“机会窗”的绝经后妇女外周阻力血管内皮功能逐渐失调,主要表现为内皮依赖性血管舒张减弱,内皮形态不良,单核-内皮粘附增多,ERT可改善上述的失调征象。同时我们的工作证实,雌激素可促进体外培养的血管内皮细胞的增殖和迁移,但是其分子机制尚有待进一步阐明。研究表明,Spred1(SProuty-related,EVH1 domain-containing Protein 1)在调控血管内皮细胞增殖和迁移方面起重要作用。Spred1可以通过抑制Ras、细胞外信号调节激酶通路所诱导的有丝分裂信号,抑制血管内皮细胞迁移和新生血管形成。雌激素是否可通过下调Spred1表达,进而促进内皮的迁移和修复,未见文献报道。因此,本课题将探讨Spred1在雌激素促内皮迁移和新生血管形成中的关键作用。近年来,血管内皮细胞中微小RNA(micro RNAs,mi RNAs)与AS之间的关系成为研究的热点。mi RNAs是一种非编码的短核苷酸链,与靶向m RNAs的3’非编码区结合,从而阻止其翻译。有报道显示,mi R-10a、mi R-33、mi R-155可抑制AS的发生发展,而mi R-21、mi R-34a的作用正好相反。研究表明,mi R-126-3p在血管内皮细胞中特异性表达,并能与Spred1 m RNA的3’UTR结合,进而抑制Spred1的蛋白翻译过程。雌激素是否通过调控mi R-126-3p表达,进而调控Spred1蛋白表达,这是本课题所研究的内容。研究表明,雌激素发挥生物学效应的主要机制是“基因组效应”。雌激素与雌激素受体(estrogen rece Ptor,ER)结合后形成复合物进入核内,作为转录因子,与DNA上的雌激素反应元件相互作用,或者通过与其它转录因子如NF-κB、SP1、Ets-1等相交联,与DNA上的NF-κB、SP1、Ets-1等特异性反应序列结合,进而调节靶基因的转录和翻译。在哺乳动物中,mi R-126由类表皮生长因子域7(Egfl7,EGF-like domain 7)基因上的内含子7编码。对Egfl7基因启动子区域进行生物信息学分析后,我们发现,Egfl7基因启动子区域存在有Ets结合位点(Ets binding sites,EBS),可与转录因子Ets-1特异性结合。而Ets-1(E26 Transformation-s Pecific Sequence-1)是公认的ER结合蛋白,可介导雌激素调控部分靶基因的效应。因此,ER有可能通过Ets-1介导,调控mi R-126-3p的表达水平。在此基础上,本研究将进一步研究E2调控Ets-1的细胞内信号转导机制。在本课题中我们招募了月经周期规律的健康育龄女性,观察了卵泡早期、排卵期、黄体期期间,女性体内血浆中mi R-126-3p的变化,并分析了其与血浆雌激素水平之间的相关性,来探究雌激素调控mi R-126-3p的体内生理效应。为进一步验证雌激素通过mi R-126-3p抑制Spred1的表达对AS的发生、发展的影响,本课题在整体动物水平上确认mi R-126-3p在雌激素延缓AS形成中的重要作用,即在载脂蛋白E基因敲除(Apo E-/-)雌性小鼠动脉粥样硬化+卵巢去势(OVX)模型中,通过尾静脉注射mi R-126-3p模拟物(mi R 126-3p mimics)或mi R-126-3p antagonist(Antago mi R-126-3p),从正反两方面观察了mi R-126-3p在雌激素抑制AS形成中的关键作用。【研究目的】本课题拟探讨雌激素通过调控mi R-126下调Spred1的表达,进而改善血管内皮功能、抑制AS形成的效应,并研究其分子调控机制,证实mi R-126在雌激素抗动脉粥样硬化形成中的重要作用。【研究方法与结果】1.雌激素通过mi R-126-3p介导延缓动脉粥样硬化发生1.1血浆E2水平与mi R-126-3p水平的相关性招募12名健康女性志愿者(为广州医科大学在校硕士生),平均年龄24岁,月经周期规律,分别于卵泡期(月经期第5-7天)、排卵期(月经期第14-16天)、黄体中期(月经期第22-24天)采集空腹血清,检测各期血清17β-雌二醇(E2)、孕酮、黄体生成素、促卵泡激素浓度以及mi R-126-3p表达水平。Wilcoxon rank sum tests分析结果显示:血清E2浓度与mi R-126-3p水平呈正相关(SPearman correlation coefficient:0.723,P<0.001)。1.2 E2/mi R-126-3p抑制动脉粥样斑块形成和Spred1表达1.2.1 6周龄Apo E-/-雌性C57BL/6小鼠,给予高脂饮食,随机分成7组(每组7-10只)。根据不同分组,小鼠接受去势手术(OVX),或在OVX术后在小鼠颈部皮下包埋E2缓释片(0.25mg,60天释放完毕),或尾静脉注射mi R-126-3p mimics、control mimics、Antago mi R-126-3p或control Antago-mi R(均为10 mg/kg/week)。具体分组如下:(1)Sham;(2)OVX;(3)OVX+E2;(4)OVX+mi R-126-3p mimics;(5)OVX+E2+antagomir-126-3p;(6)OVX+control mimics;(7)OVX+control antagomi R。上述小鼠接受处理8周后取主动脉根部行冰冻切片,油红O染色,测定主动脉根部动脉粥样硬化斑块面积。结果显示:与Sham组比较,OVX组小鼠主动脉根部粥样斑块面积显著增加(P<0.001);与OVX比较,补充雌激素后(OVX+E2组),斑块面积明显减少(P<0.01);与OVX+E2组比较,注射antago-mi R-126(OVX+E2+antagomir-126-3p组)可明显逆转E2的效应(P<0.05);单纯应用mi R-126 mimics也能减少斑块面积。这提示E2可能通过mi R-126-3p抑制动脉粥样硬化斑块形成。1.2.2主动脉根部免疫组化切片染色结果显示,在OVX组,斑块区域可见大量的Spred1表达;E2可明显抑制Spred1在斑块区域中的表达(OVX+E2组),单独应用mi R-126-3p mimics也呈现出类似E2的效应,而antago-mi R-126(OVX+E2+anta-gomir-126-3p组)可逆转E2对Spred1蛋白表达的影响。2.E2增加血管内皮细胞mi R-126-3p表达的作用机制2.1不同浓度E2处理不同时间,增加血管内皮细胞mi R-126-3p表达2.1.1体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),予以不同浓度的E2处理24 h,应用RT-PCR法观察mi R-126-3p表达情况。结果显示:与对照组比较,分别给予不同浓度的E2(1n M-1μM)处理24 h后,均能增加mi R-126-3P表达,其增加率分别为(176.5±20.2)%(n=5,P<0.05),(321.5±38.6)%(n=5,P<0.05),(266.9±31.4)%(n=5,P<0.05),(203.2±39.6)%(n=5,P<0.05)。2.1.2体外培养HUVECs,给予E2(10 n M)分别处理内皮细胞不同时间后,应用RT-PCR法观察mi R-126-3p表达情况。结果显示:与对照组比较,分别给予E2(10 n M)处理12h、24 h、48 h、72 h后,均能增加mi R-126-3p表达,增加率分别为(265.3±28.5)%(n=5,P<0.01),(341.6±35.7)%(n=5,P<0.01),(228.6±42.1)%(n=5,P<0.01),(196.5±25.6)%(n=5,P<0.01)。2.2 E2通过ERα上调血管内皮细胞miR-126-3p表达体外培养HUVECs,分别用E2(10 n M),PPT(ERα激动剂,1 n M),DPN(ERβ激动剂,1 n M)处理内皮细胞24 h,用RT-PCR检测mi R-126-3P表达情况。结果显示,E2、PPT均能上调mi R-126-3P表达,上调幅度分别为(310.6±35.6)%,(265.3±29.5)%(n=5,P<0.01),而DPN上调作用不明显。E2和PPT上调mi R-126-3p的作用可被雌激素受体抑制剂ICI所抑制(n=5,P<0.01)。由此说明,ERα参与E2上调mi R-126-3p表达的作用。2.3 Ets-1介导E2上调血管内皮细胞mi R-126-3p表达的效应体外培养HUVECs,分别转染Scrambled si RNA、SP1 si RNA和Ets-1 si RNA 48h后,再施加E2(10 n M)处理细胞24h,用RT-PCR检测mi R-126-3P表达情况。结果显示,与转染scrambled si RNA对照组比较,当沉默Ets-1表达后E2失去上调mi R-126-3P表达的效应(n=3,P<0.01),而沉默SP1表达后E2的效应不受影响。由此说明,E2通过Ets-1上调血管内皮细胞mi R-126-3P表达。2.4 E2调节Ets-1表达的作用机制2.4.1 E2可增加Ets-1转录活性体外培养HUVECs,分别转染Ets-1荧光素酶报告基因质粒(EBS-Luc,750 ng)和空载质粒PGL3(250 ng)48 h后,再施加E2(10n M),PPT(1 n M)处理细胞24 h,检测对应的荧光值。结果显示:与对照组比较,E2、PPT均能显著增加Ets-1转录活性(n=3,P<0.01),而这一作用可被雌激素受体阻断剂ICI抑制(n=3,P<0.01)。2.4.2 E2可增加Ets-1蛋白表达2.4.2.1体外培养HUVECs,以不同浓度E2(1 n M-1μM)处理24 h后,用western blot检测Ets-1蛋白的表达情况。结果显示:与对照组相比,不同浓度E2处理后Ets-1蛋白表达均增高,增加倍数分别为(2.1±0.4)(n=3,P<0.05),(2.6±0.6)(n=3,P<0.01),(1.9±0.3)(n=3,P<0.01),(1.9±0.3)(n=3,P<0.01),以10 n M浓度作用最强(n=3,P<0.01)。2.4.2.2体外培养HUVECs,选用10 n M浓度的E2分别处理内皮细胞12 h,24 h,48 h后,用western blot检测Ets-1蛋白的表达情况。结果显示:与对照组相比,E2处理不同时间Ets-1蛋白的表达均增高,增加倍数分别为(1.8±0.4)(n=3,P<0.05),(2.8±0.7)(n=3,P<0.01),(2.2±0.6)(n=3,P<0.01),其作用24h时达高峰(n=3,P<0.01)。2.4.3 E2通过c-Src/PI3K/Akt通路增加Ets-1蛋白的表达2.4.3.1体外培养HUVECs,分别用WM(PI3K抑制剂,30 n M)、PP2(c-Src抑制剂,10μM)、PD98059(MAPK抑制剂,5μM)、PTX(G蛋白抑制剂,100 ng/m L)预处理内皮细胞30min,再以E2(10 n M)处理24 h,Western blot检测Ets-1蛋白表达情况。结果显示:与E2处理组比较,WM、PP2均能抑制Ets-1蛋白表达(n=3,P<0.01),而PD98059、PTX不能阻断E2的效应。说明PI3K、c-Src通路参与E2增加Ets-1表达的作用。2.4.3.2体外培养HUVECs,分别转染Scrambled si RNA、c-Src si RNA或Akt si RNA48h后,再施加E2(10 n M)处理细胞24h。结果显示,沉默c-Src或Akt后,E2失去促Ets-1表达增加的效应;沉默c-Src后,E2不能促进Akt磷酸化;而沉默Akt蛋白表达后,E2依然可以促进c-Src磷酸化。这一结果提示c-Src为Akt的上游通路,E2通过c-Src/PI3K/Akt通路增加Ets-1蛋白的表达。3.E2对内皮细胞增殖、迁移以及血管新生的影响3.1 E2对Spred1表达的影响3.1.1体外培养HUVECs,分别给予不同浓度的E2(1 n M-1μM)处理24 h后,western blot检测Spred1蛋白的表达情况。结果显示:与对照组相比,Spred1蛋白表达随处理的E2浓度增加而降低,降低倍数分别为(0.7±0.2)(n=3,P<0.05),(0.4±0.1)(n=3,P<0.01),(0.4±0.1)(n=3,P<0.01),(0.7±0.2)(n=3,P<0.05)。3.1.2体外培养HUVECs,以10n M浓度的E2分别处理内皮细胞12 h,24 h,48 h后,western blot检测Spred1蛋白的表达情况。结果显示:与对照组相比,Spred1蛋白表达随E2处理时间增加而降低,降低倍数分别为(0.7±0.2)(n=3,P<0.05),(0.5±0.1)(n=3,P<0.01),(0.4±0.1)(n=3,P<0.01)。3.1.3体外培养HUVECs,分别转染Antago mi R-126-3p和阴性对照(control Antago-mi R-126-3p)48 h后,再施加E2(10 n M)处理细胞24 h,western blot检测Spred1表达。结果显示,与control Antago-mi R+E2组比较,转染Antago mi R-126-3p后可阻断E2对Spred1蛋白表达的抑制作用(n=3,P<0.01)。3.2 E2通过mi R-126-3p/Spred1影响内皮细胞增殖和迁移体外培养HUVECs,分别转染Spred1过表达质粒或空载质粒48 h后,再以E2(10 n M)处理细胞24 h,通过细胞增殖实验和划痕实验观察细胞增殖和迁移情况。结果显示:转染空载质粒组施加E2处理可促进内皮增殖和迁移,而过表达Spred1蛋白可显著抑制E2促内皮细胞增殖以及迁移的效应(n=3,P<0.01)。3.3 E2通过mi R-126-3p/Spred1影响血管新生体外培养HUVECs,分别转染Spred1过表达质粒或空载质粒48 h后,再以E2(10 n M)处理细胞24 h,Matrigel法观察血管生成情况。结果显示:转染空载质粒组施加E2处理可促进新生血管形成,而过表达Spred1蛋白可显著抑制E2促新生血管形成的效应(n=3,P<0.01)。【结论】1.E2通过上调Ets-1/mi R-126-3P,进而抑制Spred1蛋白表达,促进内皮细胞增殖、迁移以及新生血管形成,延缓动脉粥样硬化发生发展。2.E2通过ERα介导,激活c-Src/PI3K/Akt通路,增加Ets-1的表达。