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慢性肾脏病(CKD)和肾癌为常见的肾脏慢性疾病,是影响人类健康的全球性疾病。我国CKD患病率约为10.8%,终末期肾脏病(ESRD)患病率为0.03%,且呈逐年增高趋势。肾癌是泌尿系常见恶性肿瘤之一,约30%肾癌患者确诊时发生转移,治疗效果差。肾脏固有细胞受损是肾脏慢性疾病共同的发病基础,炎症、氧化应激、自身免疫异常等是其共同的发病机制。肾脏固有细胞一直暴露于尿液中各种诱变活性物质和毒性代谢产物之下,使得体内产生并蓄积大量活性氧(ROS),高水平的ROS可攻击线粒体DNA(mt DNA)导致其断裂,破坏mt DNA结构完整性,影响下游呼吸链相关基因转录和翻译过程,呼吸链功能障碍致使ROS水平进一步增高、氧化产物不断堆积又加重mt DNA变异,形成恶性循环,致肾脏慢性疾病的发生。由于氧化应激损伤的基因和蛋白不同,肾脏慢性疾病(肾癌和CKD)的发生及预后不同。肾癌患者治疗多以手术为主,对放化疗不敏感,预后较差;而CKD患者则会因肾小球滤过功能下降而出现一系列的水、电解质、酸碱平衡紊乱及激素分泌异常,导致尿磷排泄减少、骨调节激素异常分泌使破骨细胞活跃度增加,骨磷释放入血,继而出现高磷血症,引起血管中膜平滑肌细胞(VSMCs)发生转分化,即VSMCs成骨样改变。成骨样转变的VSMCs,诱导并加速钙磷结晶沉积于血管壁,形成血管钙化。代谢性酸中毒是慢性肾病患者常见的临床表现。酸中毒可激活破骨细胞介导的骨钙释放,促进骨的物理化学溶解,并通过成骨细胞抑制骨形成。中膜钙化的发病机制与骨形成相似[17-20]。因此,可以推测,酸中毒对骨的影响可外推到血管中膜钙化。最近的体外实验数据支持了这一观点,表明p H值的降低可以防止VSMCs中的钙沉积。但酸中毒抑制钙沉积的机制尚不清楚。鉴于此,我们拟探讨mt DNA D-loop区单核苷酸多态性在肾脏慢性疾病发生和预后中的作用,并确定酸中毒在体内外对中膜钙化的作用和机制。第一部分线粒体DNA D-loop基因多态性与CKD患者肾脏生存预后关系的研究目的:探讨线粒体DNA D-loop的SNPs与CKD患者肾脏生存预后的关系。方法:采集河北医科大学第四医院2002~2008年住院的119例CKD患者的血样。Kaplan-Meier方法用于确定CKD患者D-loop中与预后相关的SNPs。采用Cox比例风险模型分析影响CKD患者肾脏生存预后的危险因素。结果:我们鉴定了20个频率高于5%的SNPs,并评估了这些SNPs与CKD患者肾脏存活时间的关系。Log-rank检验发现146位点的SNP对预测肾脏存活时间有统计学意义。在多变量分析中,146等位基因是CKD患者肾脏存活时间的独立预测因子。146C型CKD患者肾脏存活时间明显短于146T型CKD患者。(相对危险度2.336;95%CI,1.319-3.923;P=0.001)。结论:D-loop的SNPs可以预测CKD患者的肾脏存活率。线粒体D-loop基因多态性分析有助于识别CKD患者中预后不良的高危人群。第二部分线粒体DNA D-loop基因多态性与肾透明细胞癌患者预后的研究目的:探讨线粒体DNA D-loop的SNPs与肾透明细胞癌患者生存预后的关系。方法:血液标本取自河北医科大学第四医院泌尿外科2002~2007年肾切除术后的75例肾透明细胞癌患者。还收集了68名健康对照者的血样。Kaplan-Meier方法用于确定肾透明细胞癌患者D-loop中与预后相关的SNPs。采用Cox比例风险模型分析影响肾透明细胞癌患者生存预后的危险因素。结果:在本研究中,我们评估了这些SNPs与肾透明细胞癌患者预后的关系。262C/T的SNP通过log-rank检验被确定为具有统计学意义的肾透明细胞癌患者生存预后的预测因子。多变量分析中,等位基因262被确定为肾透明细胞癌患者预后的独立预测因子。结论:对线粒体D-loop基因多态性的分析可以帮助识别肾透明细胞癌患者预后不良的高危患者亚群。第三部分酸性环境在慢性肾脏病血管钙化中的作用及可能机制目的:探讨酸中毒对慢性肾脏病血管钙化中的作用及可能机制。方法:体内实验:饲喂之前的通过5/6肾切除术构建的大鼠慢性肾衰竭模型骨化三醇,制造大鼠血管钙化。大鼠被随机分配分成四个实验组:假手术(n=6,假手术组),5/6NX+赋形剂+蒸馏水(n=5,5/6NX+DH2O+V组),5/6N X+骨化三醇600ng/kg隔日(n=5,5/6+CTR组),和5/6 NX+骨化三醇600ng/kg隔日+酸中毒(n=5,每天饮水中含0.28mmol/LNH4Cl,5/6NX+CTR+AC组);在饮水中加入0.28mmol/L氯化铵溶液,诱发5/6Nx代谢性酸中毒。实验模型成功后,在麻醉状态下从主动脉取血,将主动脉分成三部分,采用组织化学学染色von Kossa法和免疫组织化学方法对主动脉前段进行L-型钙通道(LTCC)β3亚单位和Runx2的研究。中段用于评估钙化。最后一段是对LTCCβ3亚单位和Runx2m RNA进行定量。采用分光光度法全自动生化分析仪测定血肌酐和尿素氮浓度,p H和碳酸氢盐用血气分析仪进行测定。血管钙含量的测定使用Cytation 3酶标仪测定。体外实验:血管平滑肌细胞原代培养。细胞传代培养至第3代时,进行细胞鉴定。血平滑肌细胞钙化情况通过茜素红染色检测,被染为黑色的是钙盐沉积处。测定细胞钙含量的方法:测定钙含量采取邻甲酚酞络合酮比色法,以mg/g为单位。如何评测ALP活性:根据ALP活性试剂盒,检测它的活性,最后用蛋白质校准ALP活性。采用钙离子探针检测VSMCs内钙离子浓度。免疫组织化学法检测血管Runx2和LTCCβ3表达。RT-PCR检测血管平滑肌细胞L型钙通道(calcium channels,L-type,LTCC)β3亚基和Runx2基因的表达。L型钙通道(calcium channels,L-type,LTCC)β3亚基和Runx2蛋白的表达用Western印迹检测。结果:1. 酸性环境对主动脉钙化的抑制作用在前10天内,没有任何一组记录到死亡。在第16天,5/6NX+CTR组死亡1只(1/6)。5/6 NX组死亡1只(1/10)。在体重、水和食物消耗方面,两组之间没有统计学上的显著差异。血生化检测情况如表1所示。血肌酐显著升高(P<0.05),所有5/6个NX组均增加。单纯肾切除对大鼠的酸碱平衡没有影响。5/6NX+CTR+AC组血p H和HCO3-浓度较非酸性环境对照组显著降低(P<0.05)。5/6NX+CTR组钙含量高于假手术组和5/6NX组(9.66±1.62 vs 2.33±0.42,2.41±0.41,P<0.05)。NH4Cl可有效降低钙含量(4.94±0.74,vs 9.66±1.62,P<0.05 vs 5/6 Nx+CTR)。Von Kossa染色的主动脉组织切片显示,在图2A中,NH4Cl处理的大鼠的钙沉积低于5/6 NX+CTR处理的大鼠。2. 酸性环境抑制β-甘油磷酸诱导的VSMCs钙化由于VC与VSMCs钙化相关,我们进一步研究了酸性环境对β-甘油磷酸诱导的VSMCs钙化的影响。钙含量测定显示,β-GP+p H7.4组VSMCs钙含量高于对照组(表2)。β-GP+p H7.1组低于β-GP+p H7.4组。茜素红染色结果与钙含量结果一致。(图2b)。这些数据表明,酸性环境可以抑制β-GP诱导的VSMCs钙化。3. 酸性环境抑制血管平滑肌细胞LTCCβ3亚单位的m RNA和蛋白表达,降低细胞外钙内流。LTCC起到钙通道的作用。β3亚单位是VSMCs中LTCC的主要亚型。用RT-PCR和Western-blot方法定量检测对照组、β-GP+p H7.1组和β-GP+p H7.4组的LTCCβ3亚单位的m RNA和蛋白水平。如图3所示,β-GP+p H7.1组VSMCs中LTCCβ3亚单位的m RNA和蛋白水平均低于β-GP+p H7.4组(P<0.05)。β-GP+p H7.1组Ca2+内流低于β-GP+p H7.4组(P<0.05)。这些数据表明,酸性环境可能通过抑制VSMCs中LTCCβ3亚单位的表达而降低细胞外钙的内流。4. 酸性环境对动物体内LTCCβ3亚单位和Runx2表达的影响我们研究了酸性环境对体外培养的VSMCs上LTCCβ3亚单位和Runx2表达的影响是否可以在动物体内复制。RT-PCR和免疫组织化学方法检测LTCCβ3亚基和Runx2在动物体内的变化。5/6NX大鼠用或不用NH4Cl和骨化三醇处理。如图4所示,5/6NX+CTR组LTCCβ3亚基和Runx2表达上调。5/6NX+CTR+AC组LTCCβ3亚单位和Runx2表达逐渐降低。免疫反应评分(IRS)显示,5/6NX+CTR组LTCCβ3亚基和Runx2的IRS高于Sham组和5/6NX+V组(LTCCβ3亚单位IRS:6.20±1.64,vs2.16±0.75,P<0.05 vs假手术;vs 3.00±1.00,P<0.05 vs 5/6 Nx+V;Runx2IRS:6.60±2.51,vs 1.83±0.98,P<0.05 vs假手术;vs 2.60±0.55,P<0.05vs 5/6 Nx+V)。酸性环境显著降低LTCCβ3亚单位和Runx2的表达(LTCCβ3亚单位,vs 3.83±1.33,P<0.05 vs 5/6 Nx+CTR;Runx2,vs 3.00±1.45,P<0.05 vs 5/6 Nx+CTR)。结论:酸性环境通过LTCC/Ca2+/Runx2信号通路阻止了骨化三醇诱导的血管中膜钙化。