茉莉花[Jasminum sambac（L.）Ait]是木犀科素馨属植物,茉莉花因其独特馥郁的花香,是一种闻名世界的香料作物。在我国以双瓣茉莉为原料窨制而成的茉莉花茶深受消费者青睐,而茉莉花香气利用率低是导致茉莉花茶成本高的主要原因,目前对于茉莉花香气的研究主要集中在香精油提取、香气成分测定以及生产工艺改良等方面,对于茉莉花释香的分子机理以及代谢调控方面的研究甚少。前人研究发现茉莉花中含量最高的三种香气成分是芳樟醇、α-法尼烯和乙酸苄酯,而乙酸苄酯是窨制茉莉花茶时香气吸附的主要成分。乙酸苄酯具有特征的“甜果香”,是重要的赋香成分,在印度一些茉莉精油中其含量为重要品质指标之一。乙酸苄酯由BAHD基因家族中BEAT亚家族编码的苯甲醇乙酰基转移酶,催化乙酰辅酶A的乙酰基转移到苯甲醇上形成的。本论文针对乙酸苄酯合成的分子机理以及代谢调控方面展开基础性研究,以期为高香型茉莉花的分子育种奠定基础。主要内容包括:Js BEAT相关基因的筛选,Js BEAT相关基因的功能验证以及Js BEAT上游调控因子基因的寻找。主要研究结果如下:1.筛选获得2个Js BEAT候选基因,其表达动态与花瓣中的乙酸苄酯的含量高度相关。以双瓣茉莉（Jasminum sambac）的花瓣为材料,测定茉莉花开放过程乙酸苄酯的含量,结果发现,茉莉开放后3h-9h乙酸苄酯含量较高,之后逐渐降低,具有夜间开放释香的昼夜节律。从茉莉花转录组数据库中筛选出9个Js BEAT基因,以茉莉花开放不同时间点的花瓣为材料,通过荧光定量RT-PCR分析发现,Js BEAT1和Js BEAT2基因在茉莉花开放后的6h-9h基因相对表达量较高,与乙酸苄酯释放规律一致,确定Js BEAT1和Js BEAT2基因为研究对象。通过不同组织部位的基因RT-PCR检测发现,Js BEAT基因在花瓣中相对表达量最高,在茎和叶中相对表达量较低。2.构建了一系列Js BEAT1和Js BEAT2表达载体,并明确了编码蛋白在花瓣原生质体的亚细胞定位。从茉莉花转录组数据库中Blast出Js BEAT1和Js BEAT2的CDS全长,克隆得到Js BEAT1和Js BEAT2的基因序列分别为1347bp和1338bp,通过农杆菌介导的烟草瞬时转化体系和PEG介导的茉莉花花瓣原生质体转化体系,发现茉莉花Js BEAT1和Js BEAT2基因的亚细胞定位主要在细胞质和质膜上。3.揭示了Js BEAT1和Js BEAT2的酶学特征。构建原核表达载体,体外诱导表达并纯化出重组Js BEAT1蛋白和重组Js BEAT2蛋白,二者均能催化底物苯甲醇和乙酰辅酶A生成乙酸苄酯,重组Js BEAT1蛋白对底物苯甲醇的Km值为447.3μM,重组Js BEAT2蛋白对底物苯甲醇的Km值为278.7μM,Js BEAT1对底物苯甲醇的Km是Js BEAT2的1.6倍,说明Js BEAT2与底物苯甲醇结合的能力更强。重组Js BEAT1蛋白对底物乙酰辅酶A的Km值为546μM,重组Js BEAT2蛋白对底物乙酰辅酶A的Km值为317.3μM,Js BEAT1对底物乙酰辅酶A的Km是Js BEAT2的1.7倍,说明Js BEAT2重组蛋白与底物乙酰辅酶A结合的能力更强。4.通过异源稳定表达体系验证Js BEAT1和Js BEAT2基因的功能。为了验证茉莉花Js BEAT1和Js BEAT2基因在植物体内对乙酸苄酯合成代谢的功能,由于茉莉花没有建立稳定的遗传转化体系,选择模式植物矮牵牛的异源遗传转化体系,矮牵牛具有乙酸苄酯的合成代谢途径。构建花特异性启动子LIS的过表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化矮牵牛,最后筛选出Js BEAT1的T2代3个阳性株系,Js BEAT2的T2代4个阳性株系。对转基因矮牵牛和野生型进行荧光定量RT-PCR检测,发现相比于野生型,Js BEAT1和Js BEAT2转基因株系基因相对表达量分别提高23.53倍～35.44倍、23.53倍～50.97倍。测定转基因矮牵牛和野生型花瓣中乙酸苄酯含量,发现Js BEAT1和Js BEAT2转基因株系的乙酸苄酯含量相比于野生型矮牵牛均有提高,分别提高2.06倍～3.27倍、2.33倍～3.83倍。在表型上观察到部分转基因植株出现叶片表皮变厚,形状畸形凸起,花朵开放后皱缩。5.通过启动子的生信分析和实验分析解释了Js BEAT1和Js BEAT2的潜在调控机理以及候选基因。通过染色体步移法克隆得到Js BEAT1和Js BEAT2的启动子序列,长度分别为:1474bp和1570bp,分析功能元件发现Js BEAT1和Js BEAT2基因启动子上均含有光响应、激素应答、厌氧反应、节律、MYB结合元件等有关的调控元件。ACE、Sp1、TATC-box、TCCC-motif、chs-CMA2a、CAT-box、CCAAT-box是Js BEAT1启动子区特有的,而ARE、GT1-motif、I-box、LTR、MBS、p-box是Js BEAT2启动子区特有的,说明Js BEAT不同基因成员在抗逆调节和激素响应方面可能存在功能性差异。Js BEAT1基因启动子上包含MYB、MRE、CCAAT-box与MYB结合的相关元件,Js BEAT2基因启动子上包含MBS、MYB、MRE与MYB结合的相关元件,表明Js BEAT基因的启动子能够与MYB相关转录因子结合调控花香。从转录组数据库中筛选出Js MYB转录因子,利用农杆菌介导的烟草共转化瞬时表达体系,验证了Js MYB305、Js MYB86、Js MYB108、Js LHY对Js BEAT1和Js BEAT2启动子的激活作用,结果发现,在烟草系统中,Js MYB108对Js BEAT1启动子的激活作用最强,其次是Js LHY;Js LHY对Js BEAT2启动子的激活作用最强。构建诱导型表达载体PMDC7,将Js MYB305、Js MYB86、Js MYB108和Js LHY基因转化茉莉茎段愈伤,检测茉莉愈伤中Js BEAT1和Js BEAT2基因相对表达量,分析发现,在茉莉茎段愈伤中,Js MYB305对Js BEAT1启动子的转录激活作用最强,其次是Js MYB86;Js LHY对Js BEAT2启动子的转录激活作用最强,其次是Js MYB108。在不同的植物体系中,茉莉花Js MYB转录因子对Js BEAT1和Js BEAT2启动子激活程度存在差异,由于受植物内源其他转录因子的调控影响。综上所述,本文鉴定出茉莉花中合成乙酸苄酯的2个关键酶基因Js BEAT1和Js BEAT2,两个酶具有不同的底物亲和力,但都同时存在于花瓣中,控制花香成分乙酸苄酯的形成。另外还发现了它们的上游调控因子,并显示出不一致的调控程度,这为进一步阐明茉莉的花香遗传调控机制提供了可能,也为高“甜果香”的茉莉分子育种和高香新品种选育奠定了基础,同时也为生物工程生产香料物质提供了可供选择的茉莉基因。