论文部分内容阅读
α-熊果苷作为一种安全无毒的美白制剂广泛添加于各类化妆品中,其生产方式主要靠酶催化合成,但酶合成有诸多不足。本课题尝试将表面展示系统与酶相结合,从本实验筛选出的嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas MaltopHilia BT-112)中扩增出能催化合成α-熊果苷的葡糖基转移酶XgtA基因,与冰核蛋白Inak进行N端融合将葡糖基转移酶XgtA展示在细菌表面。将构建出的基因工程菌通过IPTG诱导表达后再通过SDS-PAGE分析,该蛋白在大肠杆菌中能正确表达,且为可溶性蛋白,再利用带有荧光标签的抗体与融合蛋白末端带有的组氨酸标签结合,通过荧光显微镜和流式细胞仪证实了XgtA被展示在细胞表面。本课题对诱导条件进行初步优化,得到了最适诱导温度为15℃,诱导时间为24h,最适IPTG浓度为0.4mmol·L-1。由于对苯二酚存在底物抑制效应,所以本实验还从提高菌体自身耐受度着手,通过梯度平板筛选将能够耐受低浓度对苯二酚的菌株筛选出来,并接着利用点种法将初筛菌株进行复筛,最终得到了最大耐受浓度为4%(对苯二酚364mmol·L-1)的菌株。本课题将构建的重组菌BL21-P-I-X进行全细胞催化反应,初步确定了催化反应结束时间为72h,底物为麦芽糖,反应温度为25℃,pH值为7,对苯二酚与麦芽糖的摩尔比为1:10,且初始添加对苯二酚浓度为150mmol·L-1。在全细胞催化中人工添加抗氧化剂(抗坏血酸),和黄原胶均能减少对苯二酚对菌体的氧化作用,当添加抗坏血酸为5mmol·L-1时,α-熊果苷产量提高了43.4%；当添加黄原胶为0.1%时,α-熊果苷产量提高了53.4%。此外,本实验还以大孔树脂H103对对苯二酚进行固定化,以便高效利用对苯二酚,固定化后α-熊果苷产量提高了23.2%。本课题从解决对苯二酚毒副作用入手,对菌株筛选和保护,为之后的表面展示生产α-熊果苷提供了参考。