自闭症谱系障碍（ASD）是一类广泛神经性发育障碍疾病的总称,临床表现主要有两个核心症状:早期社会交往和交流障碍、重复刻板行为。近年来,ASD的发病率一直呈上升趋势,预后差,对患者及其家庭生活质量的影响严重。ASD除核心症状之外,还伴有许多共患病如运动障碍、睡眠异常、胃肠道紊乱、癫痫、感觉过敏和智力障碍等,这些共患病可能都加剧了ASD患者的行为异常。研究报道,大多数ASD患者都伴有一定程度的睡眠问题,最常见的睡眠问题是失眠（无法入睡或无法保持稳定的睡眠状态）和昼夜节律异常导致的睡眠-觉醒障碍。睡眠问题在正常儿童中,不仅会引发白天易怒、焦虑等情绪问题,更会对大脑的正常发育造成不良影响,导致学习记忆功能降低。而睡眠问题在ASD患者中引发的不良影响比在正常人中更加严重,除了情绪和认知发育的影响,还会加剧ASD患者的核心症状。然而对于ASD患者来说,睡眠问题往往没有得到足够的认识和重视,也没有有效的治疗措施。睡眠在动物模型上的一致性也为我们研究ASD患者的睡眠问题提供了机会,目前也已有很多对不同ASD模型小鼠睡眠问题的研究发现其的确伴有不同程度的睡眠问题,我们通过人类基因组测序筛选出一个自闭症风险基因CTNND2,连环蛋白δ2（CTNND2）位于人5号染色体短臂上,小鼠的15号染色体上,文献报道CTNND2基因和自闭症高度相关,我们通过CRISPR/Cas9基因敲除技术对小鼠进行了Ctnnd2基因敲除,并且前期实验结果已经证实Ctnnd2基因敲除（KO）后小鼠表现出ASD核心症状并伴有学习记忆能力受损,但是CTNND2是否参与睡眠的调节未见报道,Ctnnd2 KO后是否诱发小鼠睡眠-觉醒障碍,并且应用睡眠调节剂褪黑素（MT）后能否改善其睡眠-觉醒障碍也缺乏实验证据。兴奋-抑制（E/I）失衡既是自闭症核心症状发生的病因假说之一,又是睡眠-觉醒障碍的病理机制之一,GABA能中间神经元对于睡眠的诱导以及维持至关重要。因此本文首先建立了Ctnnd2 KO小鼠的自闭症模型,采用脑电（EEG）)-肌电（EMG）记录来确定Ctnnd2 KO模型鼠是否存在睡眠-觉醒障碍,以及褪黑素（MT）对Ctnnd2 KO模型鼠睡眠的影响;在此基础上,本文又对全脑GABA能递质系统进行了初步评估,以筛选出GABA能系统改变最大的脑区作为靶向研究脑区,最终解析MT是否通过与靶向脑区GABA能神经元上MT-R结合,调控GABA能神经元突触传递效能,从而改善Ctnnd2 KO小鼠睡眠-觉醒障碍的分子机制。第一部分MT改善Ctnnd2 KO小鼠的睡眠-觉醒障碍目的:验证MT干预是否可以改善Ctnnd2 KO小鼠的睡眠-觉醒障碍方法:1.采用聚合酶链式反应（PCR）确认小鼠基因型。2.采用EEG-EMG采集系统记录小鼠睡眠-觉醒状态。3.检测指标:（1）小鼠睡眠-觉醒结构中各时相的时间占比（2）小鼠睡眠-觉醒结构中各时相的发生次数（3）小鼠睡眠-觉醒结构中各时相的平均持续时间（4）小鼠睡眠-觉醒结构中各时相的EEG能谱分析结果:1 Ctnnd2 KO小鼠存在睡眠-觉醒障碍（1）与野生型（WT）小鼠相比,KO小鼠觉醒（Wake）时间所占百分比增加（P<0.05）,非快速眼动睡眠期（NREM）（P<0.05）和快速眼动睡眠期（REM）（P<0.001）时间所占百分比减少。（2）KO小鼠进入REM睡眠的次数减少（P<0.01）。（3）KO小鼠进入觉醒之后觉醒的平均持续时间增加（P<0.05）,进入REM睡眠之后REM睡眠的平均持续时间减少（P<0.05）。（4）KO小鼠觉醒期（P<0.01）和REM睡眠期（P<0.05）EEG能谱活动发生改变。2 MT干预可以改善Ctnnd2 KO小鼠的睡眠-觉醒障碍（1）与KO小鼠相比,MT干预后KO小鼠的REM睡眠时间所占百分比增加（P<0.05）。（2）MT干预后,KO小鼠进入REM睡眠的次数增加（P<0.05）。（3）MT干预后,KO小鼠进入进入觉醒之后觉醒的平均持续时间减少（P<0.05）,进入REM睡眠之后REM睡眠的平均持续时间增加（P<0.05）。（4）MT干预对KO小鼠EEG能谱活动无明显影响。结论:Ctnnd2 KO小鼠伴有明显的睡眠-觉醒障碍,主要表现为觉醒时间的延长,NREM和REM睡眠时间的减少和睡眠质量受损。而对其进行MT干预后,KO小鼠的睡眠-觉醒障碍得到了一定程度的缓解,主要表现为REM睡眠时间的增加、进入REM睡眠的次数增加、REM睡眠发生之后REM睡眠的平均持续时间增加和进入觉醒之后觉醒的平均持续时间减少;其睡眠质量没有明显改善。第二部分验证MT是否通过与GABA能神经元上MT-R结合,激活PI3K/Akt通路,增强GABA能神经元突触传递效能,从而改善Ctnnd2 KO小鼠睡眠-觉醒障碍目的:探究MT改善Ctnnd2 KO小鼠睡眠-觉醒障碍可能的分子机制。方法:1.采用Western blot对WT和Ctnnd2 KO小鼠全脑谷氨酸脱羧酶67（GAD67）和谷氨酸脱羧酶65（GAD65）的表达进行检测,筛选出最佳脑区。2.利用脑立体定位仪对Ctnnd2 KO小鼠前额皮层（PFC）分别进行MT注射、不同阻断剂注射后30 min再进行MT注射,2 h后处死取脑组织。3.采用Western blot对各组小鼠PFC中GAD67、ELKS、磷酸化突触素蛋白（p-Syn）以及磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路的表达进行检测。4.采用免疫荧光对WT和Ctnnd2 KO小鼠PFC中MT I型受体（MT1R）、MT II型受体（MT2R）和GAD67分别进行共同标记。5.采用免疫荧光对各组小鼠PFC中p-Syn和ELKS与GAD67分别进行共同标记,判断γ-氨基丁酸（GABA）能神经元突触传递效能的改变。结果:1.与WT小鼠相比,Ctnnd2 KO小鼠PFC中GAD67的表达显著降低（P<0.001）。2.对Ctnnd2 KO小鼠PFC局部注射MT后,MT通过与MT受体（MT-R）结合,激活PI3K/Akt信号通路,增强神经元的突触传递效能。3.对Ctnnd2 KO小鼠PFC局部注射MT后,MT通过与GABA能神经元上MT-R结合,激活PI3K/Akt信号通路,增强GABA能神经元突触传递效能。结论:MT可能通过与GABA能神经元上MT-R结合,激活PI3K/Akt信号通路,增强GABA能神经元突触传递效能,从而改善Ctnnd2 KO小鼠的睡眠-觉醒障碍。