论文部分内容阅读
第一部分短暂性叶酸缺乏联合小分子化合物促进鼠胚成纤维细胞重编程的研究目的研究短暂性叶酸缺乏联合新型小分子化合物组合在细胞重编程中是否可以减少外源性重编程因子的使用,提高iPS细胞的诱导效率。方法使用新的小分子化合物组合(丁酸钠,A-83-01, CHIR99021, Y-27632)联合短暂性叶酸缺乏共同作用小鼠胚胎成纤维细胞,在4因子SKOM、3因子SKO、2因子OK、1因子O的作用下诱导细胞重编程。结果小分子组合联合短暂性叶酸缺乏提高了4因子和3因子的重编程效率,同时在只有2因子OK的条件性下,产生了小鼠iPS细胞,从而无需使用Sox2和c-Myc。所得到的细胞系与小鼠ES细胞在增殖率、形态、多能性相关标记物和基因的表达方面均相似,并具有多向分化潜能。结论短暂性叶酸缺乏联合小分子化合物可提高iPS细胞诱导效率,进一步减少外源性重编程因子的使用。第二部分无饲养层、无血清条件下非整合质粒重编程HDFa成iPS细胞的研究目的研究在无饲养层、无血清条件下利用非整合附着体质粒载体和电转染技术诱导成人皮肤成纤维细胞为多潜能干细胞(induced pluripotent stem, iPS)的研究,试图构建临床级iPS细胞诱导体系。方法将冻存的成人真皮成纤维细胞复苏,在无饲养层、无动物血清条件下,采用Amaxa电转仪和lonza公司基本成纤维细胞专用电转液电转染,转染后铺于六孔板中,分别于24h、1周、2周、3周、4周利用荧光显微镜观察EGFP荧光表达情况；利用编码OCT3/4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, shRNA P53基因的非整合附着体质粒载体组合对成人真皮成纤维细胞进行重编程,并对诱导所得的iPS细胞进行形态、功能及核型鉴定。结果转染成人真皮成纤维细胞后,荧光显微镜下观察到成纤维细胞呈绿色荧光表达,提示电转染成功,转染效率约为50-60%,且随着时间延长,其荧光表达逐渐减弱,提示附着型载体会逐渐丢失。在无饲养层、无动物血清条件下,利用非整合质粒电转染成人真皮成纤维细胞,我们从3×105细胞中获得30个iPS细胞,获得的iPS细胞具有和胚胎干细胞相似的形态,保持未分化状态,免疫荧光和荧光定量PCR多能性检测均为阳性,核型分析结果为正常细胞核型,畸胎瘤检测示具有分化为三个胚层的能力。结论采用Amaxa电转仪和lonza公司基本成纤维细胞专用电转液电转染成人真皮成纤维细胞,在无饲养层无动物血清条件下,可将外源基因EGFP有效的转入细胞核内,且随着时间延长,其荧光表达逐渐减弱,可以满足重编程前期转基因高表达后期逐渐不表达的需要；利用附着体质粒载体组合电转染成人真皮成纤维细胞可以得到临床应用级别的iPS细胞,为将来的iPS细胞临床治疗研究奠定了基础。