研究背景：结直肠癌(Colorectal Carcinoma，CRC)是现今世界上最常见的恶性肿瘤之一。据WHO报道，2002年全世界新诊断CRC为102万例，占恶性肿瘤发病率第3位，死亡率第4位。随着人民生活方式、膳食结构的改变及寿命的延长，CRC的发病率及死亡率在我国也不断上升。如何有效的预防和治疗CRC，是医学界关注的重要课题之一。该病的治疗随着手术技术、以氟尿嘧啶类药物为基础的联合化疗以及放疗等治疗手段的不断完善而不断更新，为患者带来新的希望。但是西医治疗过程中使用的化学合成抗肿瘤的药物普遍存在价格昂贵、毒副作用大的缺点。因此，寻找高效、低毒的药物仍是目前CRC治疗中迫切需要解决的问题。中药苦豆子(Sophora Alopecuraides，L．)是豆科(Legum inosae)槐属多年生草本植物，目前发现，苦豆子中富含喹诺里西啶(Quinlizidine)类生物碱。本课题组在研究中发现，苦豆子总生物碱对溃疡性结肠炎具有良好的治疗作用，由于溃疡性结肠炎与CRC具有显著相关性，因此课题组对苦豆子生物碱中有过抑癌报道的苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、槐定碱进行了抗结肠癌的体外筛选，发现槐定碱(Sophoridine，SRI)有较好的抗结肠癌活性，但是国内外关于此项研究报道甚少。研究目的：1．通过体外抗肿瘤实验，观察SRI对结肠癌细胞株体外增殖抑制的作用；采用多种方法明确SRI是否能诱导结肠癌细胞产生凋亡；2．采用人结肠癌移植瘤裸鼠模型，观察SRI治疗结肠癌的体内作用；考察SRI的急性毒性以及对昆明小鼠的免疫功能的影响；3．研究SRI诱导结肠癌细胞凋亡的分子作用机制：明确SRI是否对凋亡调控分子Bcl-2、Caspase家族及NF-κB家族表达水平产生影响；寻找其诱导结肠癌细胞凋亡的相关信号转导通路或靶点。研究意义：1．明确槐定碱抗结直肠癌作用，为开发治疗结直肠癌的新型靶向制剂提供依据，以期进一步开发利用价廉、丰富的苦豆子资源，对人民健康、生态环境、经济发展大有裨益。2．采用现代实验方法对其药理学作用给予新的论释，为中药及其有效成分抗癌机制提供科学实证，也为结直肠癌的治疗开拓更为广阔的思路，对弘扬祖国传统医药具有重要意义。研究方法：1．采用MTT法、光学及荧光显微镜观察、细胞爬片HE染色、电镜观察、荧光双染、TUNEL法及凝胶电泳检测SRI体外抑制结肠癌细胞株SW480增殖及诱导其产生凋亡的作用。2．观察SRI对小鼠腹腔注射急性毒性作用及免疫功能影响；观察SRI对人结肠癌移植瘤裸鼠模型的抑制作用。3．流式细胞仪检测细胞周期改变和凋亡细胞的比例；实时定量PCR检测凋亡相关基因Caspase、Bel-2的水平；免疫印迹法检测Caspase家族蛋白以及NF-κB家族蛋白表达水平。主要研究结果：1．槐定碱抑制结肠癌细胞株作用考察1．1 MTT法检测SRI对SW480细胞生长的影响SRI对SW480细胞生长增殖抑制率随着时间和浓度的增加而增加，呈一定的时间-剂量-效应关系。对SRI作用48h的抑制率进行Probit回归分析，结果显示其IC50为0．78045 mg／ml。绘制生长曲线结果显示，正常细胞增殖曲线呈上升形态，而加入SRI后，细胞增殖受到抑制，生长曲线下降。1．2观察加药后细胞形态变化光学显微镜及荧光显微镜观察细胞：SRI作用后，细胞外形变圆，折光性增强，皱缩或脱落漂浮于培养基中；贴壁生长的细胞变得稀疏、部分细胞皱缩，胞质中颗粒增多并可见细胞膜出泡。细胞爬片HE染色可观察到加药后细胞的体积变小变圆，细胞膜出泡，核变形、皱缩，核染色质浓聚或呈月牙形边聚，偏向一侧，形成“印戒”状，胞质嗜酸性增强。电镜下可见SRI处理后，细胞皱缩，胞体缩小，细胞膜表面微绒毛消失；可以见到核染色质多种凋亡形态学改变。1．3 AO／EB双染荧光、Hoechst染色与TUNEL法检测细胞凋亡AO／EB双染荧光显微镜观察结果发现SRI作用后可见各期凋亡细胞；经SRI0．4 mg/ml作用48h后，凋亡率达到28．8±4．4％，作用72h即可达到44．5±3．9％；SRI0．8 mg／ml作用48h，凋亡率达到38．7±3．4％，72h达到67．5±5．9％。Hoechst染色可见典型的凋亡形态学改变：核染色质聚集、核碎裂、胞质浓缩，被染成明亮的蓝色荧光。TUNEL法可见凋亡细胞表现出的明亮的斑块状绿色荧光。1．4 DNA片段化及免疫细胞化学结果对照组细胞DNA没有出现片段化，0．4 mg／ml SRI作用细胞48h后基因组DNA开始降解，出现模糊的梯状条带，72h可见非常典型的“梯状条带”；0．8 mg／mlSRI作用细胞48h、72h基本形成典型条带。结果显示，低浓度长时间的作用使基因组DNA片段化更为突出。免疫细胞化学染色可见对照组中大量细胞呈Bcl-2阳性表达，Caspase-3基本为阴性表达；而0．8 mg／ml SRI作用后Bcl-2阳性表达细胞数显著减少，而Caspase-3阳性细胞数增加，与对照组比较有统计学意义(P<0．05)。2．小鼠急性毒性实验及免疫实验给药后，各组小鼠出现短暂自主活动减少，双目紧闭，蜷缩，随后即出现兴奋、跳跃；较低剂量组动物在半小时后状态恢复如常，活动自如；高剂量组小鼠有不同程度神经系统症状，部分小鼠给药1小时内出现死亡。对各组小鼠死亡数目进行Probit回归分析，确定其腹腔注射给药LD50为65．19337 mg／kg，其95％可信区间为59．01544mg／kg-74．41568 mg／kg。分别以25 mg／kg、15 mg／kgSRI腹腔注射昆明小鼠给药两周，结果表明：与阴性对照组比较，SRI组昆明小鼠体重，胸腺、脾脏指数没有显著性差异，病理切片显示胸腺、脾脏没有明显改变；阳性对照药5-氟尿嘧啶(5-Fu)导致小鼠胸腺、脾脏指数均显著降低(P<0．05)，病理切片显示该组胸腺、脾脏严重萎缩。3．SRI对人结肠癌移植瘤裸鼠模型的抑制作用SPF级BALB／c裸鼠皮下接种人结肠癌细胞株SW480-EGFP，成瘤后，分组给药，结果显示SRI高剂量25 mg／kg，低剂量15 mg／kg组及生理盐水组裸鼠精神状态均良好，活动正常；SRI各组瘤块生长缓慢，移植瘤的重量和体积增长显著低于阴性对照组(P<0．01)。SRI高剂量组和5-Fu组抑瘤率分别为62．4±4．3％及69．0±2．3％，其相对肿瘤体积与阴性对照组比较差异亦有统计学意义(P<0．01)。病理切片可见SRI组肿瘤细胞正常结构消失，可见细胞松散，胞浆空泡，胞核变形，可见片状坏死区域，凋亡细胞增多。电镜下除可见大量坏死肿瘤细胞外，亦可见到凋亡细胞，其细胞质密度增高或呈空泡状，染色质高度凝集固缩，可见到类圆形凋亡小体。4．SRI抗结肠癌机制研究实时荧光定量检测凋亡相关基因：结果显示SRI处理细胞后，与阴性对照组比较，Bcl-2基因表达水平显著降低(P<0．05)，而Caspase-3表达显著升高(P<0．05)。Bcl-2的表达与细胞凋亡及Caspase-3的表达呈负相关。流式细胞术检测细胞周期变化：0．8 mg／ml SRI作用SW480细胞48h后，G0／G1期细胞数随着作用时间的延长而增多，与阴性对照组比较有显著性差异(P<0．01)，同时S期细胞比例也显著减少(P<0．01)，G2／M期细胞比例相应减少，在G1峰前出现亚二倍体凋亡峰。流式散点图可见SRI作用24h及48h后第3，4象限凋亡细胞数增多，凋亡率分别达到20．15±0．78％和29．98±1．22％，与阴性对照组比较具有显著性差异(P<0．01)。免疫印迹法检测Caspase家族及NF-κB家族蛋白表达：使用SRI作用于SW480细胞不同时间，结果显示阴性对照组始终无断裂片段出现，只有完整的Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9和PARP条带；在作用12h后，Caspase-9和PARP开始出现断裂条带；Caspase-3在作用24h后开始、Caspase-7在作用48h开始出现断裂片段。随着SRI作用时间的增加，NF-κB逐渐减少而磷酸化NF-κB逐渐增加；磷酸化IκBα表达也逐渐增加，提示NF-κB通过与IκBα脱离而被激活。同时细胞内磷酸化IKKβ的表达增加，没有出现磷酸化IKKα的表达。结论：1．SRI能够显著抑制结直肠癌细胞株SW480的体外增殖并诱导其产生凋亡。其抑制增殖作用呈现一定的时间-剂量-效应关系；其作用48h的IC50为0．78045mg／ml；经SRI作用后，细胞出现凋亡形态学改变和DNA片段化，凋亡相关基因和蛋白随之发生变化。2．SRI能够抑制裸鼠接种人结肠癌移植瘤模型的肿瘤生长，具有明确的治疗结直肠癌的作用，同时对正常小鼠的免疫功能没有抑制，不影响其体重正常增长。SRI在整体实验条件下具有一定的毒性，该药对昆明小鼠一次性腹腔注射LD50为65．19337 mg／kg。3．SRI能够增加促凋亡因子Bcl-2的表达，可能对Bcl-2家族通路产生影响；并且可能通过影响细胞周期变化诱发凋亡。4．SRI能够活化凋亡相关蛋白Caspase-9、Caspase-3、Caspase-7及其底物PARP的表达，提示其可能通过经典的线粒体途径诱导细胞产生凋亡。5．SRI能够导致NF-κB进入胞内传递信息，对该通路产生影响，这一作用与其影响IκB的磷酸化，并使磷酸化IKKβ的表达增加有关。6．结合文献研究及实验结果，推测SRI诱导凋亡的通路之一为：SRI→SW480→IKKβ磷酸化→p50-p65-IkB解离→NF-κB→Bcl-2家族→Caspase激活→凋亡，此推断还需进一步实验证明。