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巴斯德毕赤酵母表达系统属于真核表达系统,利用酵母系统表达外源蛋白的技术变得越来越成熟。牛乳铁蛋白具有广谱的抗细菌、抗病毒、抗肿瘤及参与免疫调节等多种生物学活性,在食品添加剂、化妆品行业以及饲料添加剂中具有广阔的应用前景。由于从牛乳中提取乳铁蛋白成本高,因此,无法广泛应用于工业化生产。本课题选择利用毕赤酵母表达系统对牛乳铁蛋白功能片段进行分泌表达,进而对目的蛋白进行纯化、鉴定及功能性研究,并研究了目的蛋白在不同高密度发酵培养基中的表达差异,研究结果如下:论文以较小分子量的牛乳铁蛋白N端功能片段（包括两个功能结构域的1333氨基酸序列,Bovine lactoferrin Functional fragment,BlfFf）为重组表达目标,电转入毕赤酵母GS115中,通过组氨酸缺陷型与G418梯度抗性筛选得到耐不同抗性的阳性转化子,利用SDS-PAGE与Western Blot对目的蛋白进行鉴定,确定重组牛乳铁蛋白功能片段是否得到表达。提取不同抗性阳性转化子的基因组,利用荧光定量PCR双标准曲线法,筛选得到1、2、3、4个拷贝的菌株,将菌株进行摇瓶发酵诱导,使用ELISA试剂盒,对目的蛋白进行定量分析,结果表明,4拷贝菌株表达量较高,摇瓶产量达到1.9 mg/L,与单拷贝菌株相比表达量增加接近25%,将该菌株命名为GS115-pPIC9K-BlfFf-10。对发酵诱导表达上清进行纯化条件优化,结果表明,使用阳离子交换层析与镍亲和层析相结合的方法效果最佳,阳离子交换层析过程中,目的蛋白回收率达到45.7%,镍亲和层析过程中,目的蛋白回收率为54.0%,整个纯化过程的目的蛋白总回收率达到20.6%,成功获得电泳纯的牛乳铁蛋白功能片段,对SDS-PAGE进行切胶回收后得到的牛乳铁蛋白功能片段进行LC-MS鉴定,其鉴定结果的分子量以及序列与软件预测相符合。对得到的牛乳铁蛋白功能片段进行抗菌研究,结果发现,牛乳铁蛋白功能片段经胃蛋白酶切后对金黄色葡萄球菌与大肠杆菌均有良好的抗菌效果,抑菌率分别达到69.86%与52.49%。对GS115-pPIC9K-BlfFf-10菌株的发酵条件在摇瓶的水平上进行优化。优化后的发酵条件为培养基初始pH 5.0,摇瓶装液量为50 mL（500 mL锥形瓶）,每24 h甲醇添加量2.0%,诱导温度为28℃时,效果最佳。使用5L发酵罐分别比较了RDM、BSM、D’Anjou三种高密度发酵培养基对牛乳铁蛋白功能片段表达的影响,结果表明:经过72 h发酵诱导,RDM、BSM、D’Anjou培养基中菌体湿重分别达到380 g/L、342 g/L、285 g/L;牛乳铁蛋白功能片段表达量分别为38.1mg/L、29.52 mg/L、20.25 mg/L;菌株在三种培养基中平均比生长速率为0.0128 h-1、0.0175 h-1、0.009 h-1,综合比较实验结果,最终选择RDM为高密度发酵培养基,它既可以减少培养基成本,又可以减少分离纯化过程中的脱盐成本,更具有工业应用的潜力。