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研究背景:由人类果蝇相关基因――HERG (Human ether-a-go-go-related gene)编码的心脏HERG钾通道属于电压依赖性钾通道,介导快速激活延迟整流钾电流(rapidly activated delayed rectifier potassium currents, Ikr)。HERG基因的突变将导致第二型的长QT综合征(long QT syndrome,LQTS)。蛋白质-蛋白质相互作用是维持细胞生命活动的重要基础,信号转导、细胞周期调控、DNA复制、RNA转录、蛋白质翻译、蛋白质翻译后加工修饰等功能的完成依赖于蛋白质-蛋白质的相互作用。既往的研究表明FHL1通过与心脏钾通道相互作用而发挥调控该通道所介导电流IKs ( the slowly activating component of the delayed rectifier K+ current, IKs )的功能。IKs和Ikr电流都属于延迟整流钾电流,是构成心脏动作电位第3相的主要外向电流,对心脏复极发挥极其重要的作用。而FHL1和FHL2的氨基酸构成有着47%的同源性。本实验的前期工作通过酵母双杂交技术、GST pull-down发现了FHL2与心脏HERG钾通道存在相互作用。在此基础之上,本实验进一步研究FHL2对心脏HERG钾通道表达的调控作用,旨在更深刻了解心脏HERG钾通道的调控机理,为LQTS的治疗提供新思路。目的:阐明FHL2对心脏HERG钾通道道白表达水平的调控作用,进一步明确FHL2对心脏HERG钾通道功能的影响作用。方法:(1)以PCR法扩增FHL2基因的开放阅读框(open reading frame,ORF),并分别在其5’端及3’端加上EcoRI和XhoI酶切位点,将其克隆进入载体pcDNA3.0构建重组质粒pcDNA3.0-FHL2。(2)原代乳鼠心肌细胞的培养:取出生24 h内大鼠左心室,剪碎, 0.25%胰蛋白酶分离,离心收集心肌细胞,差速贴壁法和化学试剂法抑制非心肌细胞生长,纯化后培养于DMEM培养基。(3)利用脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.0-FHL2、针对人类FHL2的siRNA分别转染乳鼠原代心肌细胞。(4)将转染后乳鼠心肌细胞提取的蛋白用Western blot检测蛋白质表达水平:分别加入FHL2一抗(鼠来源)和HERG一抗(羊来源),验证FHL2对HERG钾通道蛋白表达的影响。(5)FHL2和HERG在HEK-293细胞的表达:应用脂质体Lipofectamine 2000将重组质粒pcDNA3.0-HERG转染HEK-293细胞,以及将pcDNA3.0-FHL2、pcDNA3.0-HERG共转染HEK-293细胞,免疫荧光细胞化学分析,应用抗HERG和抗FHL2的抗体显示HERG及FHL2的细胞定位。(6)在HEK-293细胞中,利用膜片钳技术,研究FHL2对HERG钾通道功能的影响。结果:(1)成功构建重组质粒pcDNA3.0-FHL2,酶切鉴定及测序结果正确。(2)针对FHL2的siRNA通过Lipofectamine 2000转染乳鼠原代心肌细胞后,Western blot检测FHL2蛋白的表达量减少,而转染重组质粒pcDNA3.0-FHL2的乳鼠心肌细胞,Western blot检测FHL2蛋白的表达量增加。(3)FHL2蛋白抑制表达时,HERG钾通道蛋白表达量减少;FHL2过度表达时,HERG钾通道蛋白表达量增加。(4)膜片钳检测发现,在HEK-293细胞单独表达HERG时,电流为400±30 pA,同时表达HERG和FHL2时,电流增加到839±44 pA,两组之间进行t检验,t =-30.614, p=0.000, p<0.001,可见FHL2在增大HERG电流幅度的同时并调节其激活过程。结论:FHL2蛋白的过度表达能上调心肌细胞HERG钾通道的表达水平,并使HERG钾通道电流振幅增大;FHL2蛋白的抑制表达能下调心肌细胞HERG钾通道的表达水平。本实验结果提示FHL2对心脏HERG钾通道的表达及功能具有正性调控作用,这一结果将为开发治疗LQTS的新型蛋白质药物提供新思路。