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目的:Zn(锌)缺乏参与到食管癌的发生发展中,miRNAs是缺Zn影响食管癌发生的重要途径,而ZIP5(SLC39A5)调控着体内Zn水平,目前尚无关于miRNAs与ZIP5表达相关的研究,因此本实验旨在研究食管癌高发区中与调控ZIP5表达相关的miRNAs分子机制,以阐明miRNAs在食管癌中发挥的作用,从而为miRNAs在我国食管癌高发区患者的有效诊断和精准治疗中提供实验依据与方向。材料与方法:1对象:1.1细胞系:人正常食管癌细胞NE1,人食管癌细胞KYSE150,KYSE170,Eca109,KYSE9706,TE1,工具细胞293T。1.2组织:48例2016-2017年间由河北医科大学第四医院胸外科提供的食管癌高发区磁县食管癌患者癌及癌旁非肿瘤组织。2实验方法:2.1应用数据库筛选与ZIP5,Zinc可能相关的miRNAs。2.2应用梯度浓度TPEN培养KYSE150和KYSE170食管癌细胞,模拟食管癌高发区低锌环境,观察细胞生长情况,并进一步应用qRT-PCR检测不同浓度TPEN下食管癌细胞中miRNAs的表达。2.3应用免疫荧光素酶实验验证miR-193b与ZIP5间的关系。2.4应用qRT-PCR检测miR-193b在永生化食管上皮细胞系NE1和食管癌细胞系中的表达。2.5应用转染质粒miR-193b mimics和inhibitor构建过/低表达miR-193b的食管癌细胞系。2.6应用MTS和克隆形成实验、划痕实验、Transwell小室侵袭实验及流式细胞术,分别检测过/低表达miR-193b对食管癌细胞增殖、迁移、侵袭、细胞周期及凋亡的影响。2.7应用RT-PCR和Western blot检测过/低表达miR-193b基因后对ZIP5,CyclinD1及E-cadherin mRNA及蛋白表达水平的影响。2.8应用HE染色检测食管癌患者癌及癌旁非肿瘤组织的组织学类型。2.9应用qRT-PCR的方法检测ZIP5和miR-193b在锌缺乏地区48例食管鳞癌(ESCC)患者肿瘤与癌旁非肿瘤组织中的表达,并分析miR-193b的表达与ESCC患者临床病理资料,ZIP5间的关系。3.统计学方法:所有数据采用SPSS21.0软件进行统计学分析,计量资料采用t检验或单因素方差分析,计数资料采用χ2或校正χ2检验,相关性分析采用Spearman相关。结果:1 miR-193b的筛选及其与ZIP5间关系的验证1.1利用mirDPI,Sanger,Pictar数据库筛选与ZIP5,Zinc相关的miRNAs发现,miR-193b,miR-328以及miR-137可能与ZIP5,Zinc相关。1.2 qRT-PCR检测结果显示:在一定TPEN浓度范围内,随着培养基中TPEN浓度的升高,食管癌细胞中miR-193b的表达水平逐渐降低,差异均具有统计学意义(P<0.05);然而,随着TPEN浓度升高,miR-328和miR-137的表达差异均无统计学意义(P>0.05),这提示miR-193b可能与Zn离子水平相关,因此选择miR-193b做后续的研究对象。1.3 Targetscan数据库显示miR-193b与ZIP5的引物序列存在碱基互补,免疫荧光素酶结果显示,加入miR-193b mimics后,ZIP5 3’UTR WT组细胞的荧光活性(0.72±0.03)与ZIP5 3’UTR NC(1.00±0.00)相比明显减弱(P<0.05),而ZIP5 3’UTR MUT组荧光活性表达(0.96±0.02)与ZIP53’UTR NC(1.00±0.00)相比无统计学意义(P>0.05),这提示ZIP5是miR-193b的靶基因。2细胞水平上miR-193b在食管癌中的功能机制研究2.1 MiR-193b在正常食管上皮以及食管癌细胞系中的表达及过表达/低表达miR-193b食管癌细胞系的构建:miR-193b在正常食管上皮细胞中的表达水平为0.71±0.03,均高于Eca109(0.45±0.03),KYSE150(0.23±0.02),KYSE170(0.27±0.01),KYSE9706(0.43±0.02),TE1(0.30±0.03)等食管癌细胞,差异具有统计学意义(P<0.05),因此选择在KYSE150、KYSE170食管癌细胞中做miR-193b基因的过表达,在Eca109和KYSE9706食管癌细胞中做miR-193b基因的低表达并进行后续实验。2.2过/低表达miR-193b对细胞增殖能力的影响:MTS实验结果:过表达miR-193b基因后,KYSE150和KYSE170细胞的增殖能力受到抑制(KYSE150:0.68±0.04 vs 0.84±0.07和0.89±0.04,P<0.05;KYSE170:0.66±0.07 vs 0.76±0.06和0.79±0.07,P<0.05),低表达miR-193b基因可以促进Eca109以及KYSE9706食管癌细胞的增殖能力(Eca109:0.58±0.05vs 0.44±0.03和0.44±0.04,P<0.05;KYSE9706:0.72±0.06 vs 0.64±0.03和0.64±0.03,P<0.05)。细胞克隆形成试验进一步对miR-193b对食管癌细胞的增殖能力的作用进行了验证,结果与MTS一致,过表达miR-193b后,可以抑制食管癌细胞KYSE150及KYSE170细胞的克隆细胞数(KYSE150:104.67±2.52 vs 247.67±2.52和251.67±2.08,P<0.05;KYSE170:115.33±6.51 vs 251.67±4.04和257.67±2.52,P<0.05),低表达miR-193b可以增加克隆形成细胞团的数量(Eca109:342.00±4.00 vs250.67±3.79和255.67±4.51,P<0.05;KYSE9706:329.67±2.52 vs256.33±3.51和261.00±1.00,P<0.05)。2.3过/低表达miR-193b后对细胞迁移能力的影响:结果显示:过表达miR-193b可以抑制食管癌细胞的迁移能力(KYSE150:53.70%±4.90%vs30.31%±13.48%和26.08±9.88%,P<0.05;KYSE170:60.15%±4.00%vs28.26%±8.18%和19.11%±2.38%,P<0.05),低表达miR-193b可以促进食管癌细胞的迁移能力(Eca109:14.02%±2.79%vs 28.92%±3.62%和22.51%±4.63%,P<0.05;KYSE9706:22.20%±3.41%vs 43.43%±4.46%和39.10%±0.05%,P<0.05)。2.4过/低表达miR-193b后对细胞侵袭能力的影响:过表达miR-193b基因可以抑制食管癌细胞的侵袭能力(KYSE150:89.67±7.51 vs 278.33±7.64和288.33±12.58,P<0.05;KYSE170:106.00±6.56 vs 284.33±10.79和300.00±10.00,P<0.05),低表达miR-193b基因可以促进食管癌的侵袭能力(Eca109:315.33±5.51 vs 285.67±14.01和295.67±4.04,P<0.05;KYSE9706:361.67±12.58 vs 283.67±7.77和290.33±1.53,P<0.05)。2.5过/低表达miR-193b后对细胞周期的影响:过表达miR-193b基因可以通过作用于食管癌细胞周期的G1期从而抑制细胞周期的进行,(KYSE150:64.03±2.31 vs 53.15±3.70和53.96±5.36,P<0.05;KYSE170:60.96±1.57 vs 50.08±2.66和52.25±4.17,P<0.05),低表达miR-193b基因可以通过促进细胞从G1期向S期转化从而促进细胞的增殖(Eca109:44.53±3.51 vs 54.27±4.90和54.54±3.90,P<0.05;KYSE9706:48.59±0.06vs 52.02±0.68和51.42±1.05,P<0.05)。2.6过/低表达miR-193b后对细胞凋亡的影响:由于过/低表达miR-193b后,食管癌细胞的凋亡比例均低于5%,故不认为miR-193b对食管癌的凋亡有影响。2.7过/低表达miR-193b后对ZIP5、Cyclin D1及E-cadherin基因m RNA水平的影响:过表达miR-193b基因可以抑制ZIP5、Cyclin D1基因m RNA的表达(KYSE150:ZIP5:0.14±0.01 vs 0.20±0.04和0.19±0.04,P<0.05;Cyclin D1:0.46±0.17 vs 0.88±0.13和1.01±0.16,P<0.05;KYSE170:ZIP5:0.26±0.01 vs 0.38±0.03和0.35±0.02,P<0.05;Cyclin D1:0.63±0.06 vs0.95±0.18和0.96±0.14,P<0.05),促进E-cadherin基因的表达(KYSE150:0.11±0.02 vs 0.05±0.02和0.05±0.03,P<0.05;KYSE170:0.94±0.16 vs0.56±0.08和0.57±0.09,P<0.05),低表达miR-193b基因可以促进ZIP5、Cyclin D1基因m RNA的表达(Eca109:ZIP5:0.25±0.04 vs 0.15±0.01和0.15±0.02,P<0.05;Cyclin D1:1.08±0.05 vs 0.89±0.11和0.86±0.02,P<0.05;KYSE9706:ZIP5:1.02±0.17 vs 0.25±0.01和0.25±0.03,P<0.05;Cyclin D1:1.26±0.11 vs 0.97±0.07和0.96±0.09,P<0.05),可以降低E-cadherin基因的表达(Eca109:0.07±0.03 vs 0.12±0.01和0.14±0.02,P<0.05;KYSE9706:0.21±0.02 vs 0.85±0.29和0.86±0.22,P<0.05)。2.8过/低表达miR-193b后对ZIP5、Cyclin D1及E-cadherin基因蛋白水平的影响:过表达miR-193b基因可以抑制ZIP5、Cyclin D1基因蛋白的表达(KYSE150:ZIP5:0.44±0.02 vs 0.82±0.01和0.78±0.05,P<0.05;Cyclin D1:0.31±0.01 vs 1.39±0.03和1.35±0.04,P<0.05;KYSE170:ZIP5:0.30±0.01vs 0.73±0.04和0.68±0.05,P<0.05;Cyclin D1:0.52±0.03 vs 1.03±0.11和1.05±0.10,P<0.05),促进E-cadherin基因的表达(KYSE150:0.72±0.02 vs0.65±0.02和0.65±0.01,P<0.05;KYSE170:0.86±0.03 vs 0.43±0.01和0.42±0.06,P<0.05),低表达miR-193b基因可以促进ZIP5、Cyclin D1基因蛋白的表达(Eca109:ZIP5:1.03±0.05 vs 0.63±0.07和0.63±0.09,P<0.05;Cyclin D1:0.79±0.01 vs 0.35±0.02和0.39±0.03,P<0.05;KYSE9706:ZIP5:0.81±0.01 vs 0.33±0.01和0.32±0.01,P<0.05;Cyclin D1:0.91±0.01 vs0.34±0.02和0.33±0.01,P<0.05),可以降低E-cadherin基因的表达(Eca109:0.45±0.03 vs 0.98±0.07和0.97±0.09,P<0.05;KYSE9706:0.36±0.02 vs0.80±0.02和0.78±0.05,P<0.05)。3 miR-193b在锌缺乏地区ESCC患者组织中的表达及与ZIP5间的相关性3.1 miR-193b在48例高发区ESCC患者癌组织中表达(0.45±0.19)降低,与癌旁非肿瘤组织(0.90±0.32)相比,其表达量下调了2倍(P<0.05)。3.2 miR-193b的表达与食管癌高发区ESCC患者的淋巴结转移和TNM分期相关(淋巴结转移:χ2=15.965,P=0.000;TNM分期:χ2=14.106,P=0.000)。3.3 ESCC患者组织中miR-193b与ZIP5的相对表达水平呈负相关关系(r=-0.509,P=0.000)。结论:1.低Zn培养食管癌细胞以及免疫荧光素酶实验提示miR-193b可能与Zn离子有关,ZIP5是miR-193b的直接靶标。2.miR-193b可以通过影响ZIP5,Clylin D1和E-Cadherin的表达水平,从而作用食管癌的增殖,迁移和侵袭过程。3.miR-193b在食管癌组织中表达降低,且与患者的淋巴结转移和TNM分期相关;miR-193b与ZIP5在食管癌患者组织中的表达水平呈负相关关系。