第一部分膀胱移行细胞癌组织中PTEN表达及其与血管生成的关系一、膀胱移行细胞癌组织中PTEN的表达及其与MVD的相关性目的PTEN是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，其表达与肿瘤的进程和预后相关。本实验研究不同因素的患者膀胱癌组织中抑癌基因PTEN的表达情况及其与微血管密度（MVD）之间的关系，评价PTEN在膀胱癌发生发展中对肿瘤血管生成的作用。方法应用免疫组织化学S-P法检测62例膀胱癌组织和18例良性膀胱病变组织中PTEN和FⅧRAg（FⅧRAg为血管内皮细胞特异性标志物，用于计数MVD）的表达，同时结合患者的性别、年龄，肿瘤分期、分级进行分析，判断上述因素对膀胱癌组织PTEN表达的影响，并分析PTEN表达与MVD之间的关系。结果62例膀胱癌组织中PTEN阳性率为53.23％（33／62），18例良性膀胱病变组织PTEN全部阳性表达，PTEN的表达与肿瘤分级密切相关（P＜0.05），而患者性别、年龄和肿瘤分期对PTEN的表达无明显影响；肿瘤组织MVD明显高于良性病变组织（P＜0.05），MVD与肿瘤分级密切相关（P＜0.01），而患者性别、年龄和肿瘤分期对MVD无明显影响；经Spearman相关分析显示，在不同恶性程度的膀胱癌中，PTEN表达与MVD之间呈负相关（r=-0.532，P＜0.01）。结论PTEN基因可能具有抑制血管生成的作用，其异常改变促进肿瘤血管形成，有助于肿瘤恶性演变。PTEN基因突变或缺失所导致的表达障碍可能在膀胱癌的恶性进展、肿瘤浸润转移及血管生成过程中发挥重要的作用并与肿瘤的预后相关。二、PTEN和VEGF的表达与膀胱癌血管生成的关系目的研究膀胱癌组织中抑癌基因PTEN和血管内皮生长因子（VEGF）的表达情况及其与膀胱癌微血管生成（即微血管密度MVD，利用FⅧRag免疫组化染色来计数）的关系，评价PTEN和VEGF在膀胱癌进展中作用。方法应用免疫组织化学S-P法检测62例膀胱癌组织和18例良性膀胱病变组织中PTEN和VEGF的表达，统计PTEN表达与VEGF表达之间的关系，同时分析在PTEN和VEGF不同表达状态下，膀胱癌组织MVD的变化，膀胱癌按照PTEN和VEGF的表达状况分成4组，组1为PTEN阴性VEGF阳性（n=19）。组2为PTEN阴性VEGF阴性（n=10），组3为PTEN阳性VEGF阳性（n=20），组4为PTEN阳性VEGF阴性（n=13）。结果PTEN在对照组和膀胱癌组中的阳性率分别为100.0％（18／18）和53.2％（33／62）；VEGF在对照组和膀胱癌组中的阳性率分别为27.8％（5／18）和62.9％（39／62），2组间差异均有统计学意义（x²=13.207，P＜0.01；x²=6.954，P＜0.01）。经Spearman相关分析，PTEN表达与VEGF表达之间呈负相关（r=-0.832，P＜0.01）。组1-4和对照组的MVD分别为41.53±10.09，31.40±8.28，26.55±8.57，25.15±8.73和19.44±7.32。除第4组外（P＞0.05），其它3组的MVD与对照组比较均有显著性差异（P＜0.05）。组1-4间两两比较，仅组1的MVD显著高于其它三组（P＜0.05）；其它3组间MVD开显著性差异。结论PTEN在膀胱癌中的表达较对照组明显降低，而VEGF表达增高，二者呈负相关。本实验还比较了不同PTEN和VEGF表达状态下膀胱癌MVD的差异。结果表明，在PTEN阴性、同时VEGF阳性情况下，膀胱癌MVD最高，与其它组有显著性差异。提示，膀胱癌PTEN失活可能通过增加VEGF的表达来促进血管的生成，导致肿瘤恶性进展。第二部分PIEN基因转染对人膀胱癌细胞系BIU-87体内外生物活性的影响一、PTEN基因转染对人膀胱癌细胞系BIU-87增殖力和侵袭性的影响目的研究外源性抑癌基因PTEN转染对人膀胱癌细胞系BIU-87增殖活性和侵袭力的影响，探索膀胱癌基因治疗的新靶点，从而为膀胱癌的基因治疗提供新的思路和靶点。方法将携有PTEN基因的重组真核表达质粒pBp-PTEN转化大肠杆菌DH5α并扩增，抽提纯化质粒并进行酶切鉴定，pBp-PTEN体外转染BIU-87细胞（pBp-PTEN-BIU87）筛选稳定转染的细胞并扩增培养，以转染了空质粒pBp的BIU-87细胞（pBp-BIU87）和未转染的BIU-87细胞为对照，用RT-PCR和细胞免疫化学检测PTEN的表达情况，并用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）和细胞侵袭小室分别检测PTEN基因转染前、后BIU-87细胞体外增殖和侵袭活性的变化。将细胞分别接种于裸鼠，观察肿瘤的生长情况，以比较PTEN基因对BIU-87细胞体内增殖能力的影响。结果pBp-PTEN的酶切鉴定证实含有目的基因PTEN；pBp-PTEN-BIU87细胞的RT-PCR产物经凝胶电泳有明显的阳性条带，而对照组则无；细胞免疫组化证实ppBp-PTEN-BIU87细胞的PTEN阳性细胞率明显高于对照组细胞；MTT发现，pBp-PTEN-BIU87细胞在第2、3和4天的吸光度值A明显低于两对照组（P＜0.05），以正常BIU-87细胞为对照，PTEN基因在第1、2、3和4天的细胞生长抑制率分别为4.27％、18.92％、19.54％和17.69％。；细胞侵袭试验显示，各组细胞浸润穿透ECM层的数目：pBp-PTEN-BIU8为39.3±7.7，BIU-87和pBp-BIU87分别为48.1±13.2和48.9±11.0，pBp-PTEN-BIU87细胞明显少于两对照组（P＜0.05）；裸鼠致瘤实验发现pBp-PTEN-BIU87在裸鼠中的成瘤速度较其它两种对照细胞缓慢。结论抑癌基因PTEN转染能降低膀胱癌细胞的体内、外增殖活性和侵袭力，从而可能在一定程度上达到抑制肿瘤发生、发展的目地。这提示了以PTEN为靶点的基因治疗的可行性。二、PTEN基因转染对人膀胱癌细胞系BIU-87凋亡的影响目的研究外源性抑癌基因PTEN转染对人膀胱癌细胞系BIU-87凋亡的影响，探索膀胱癌基因治疗的新途径。方法将携有PTEN基因的重组真核表达质粒pBp-PTEN转化大肠杆菌DH5α并扩增，抽提纯化质粒并进行酶切鉴定，pBp-PTEN体外转染BIU-87细胞（pBp-PTEN-BIU87），筛选稳定转染的细胞并扩增培养，以转染了空质粒pBp的BIU-87细胞（pBp-BIU87）和正常BIU-87细胞为对照，用RT-PCR检测PTEN的表达情况，应用细胞原位凋亡检测试剂盒和流式细胞仪分别研究PTEN基因转染前、后膀胱癌细胞凋亡情况的变化。结果稳定转染PTEN基因的膀胱癌细胞系BIU-87中PTEN mRNA能稳定表达。原位细胞凋亡检测发现，pBp-PTEN-BIU87细胞的凋亡指数为（14.28±2.49）％，而pBp-BIU87细胞和BIU-87细胞的凋亡指数分别为（9.18±2.85）％和（10.75±3.15）％。经统计，pBp-PTEN-BIU87，细胞的的凋亡指数明显高于其它两组，具有统计学意义（P＜0.01）。流式细胞仪检测发现pBp-PTEN-BIU87，pBp-BIU87和BIU-87的细胞凋亡率分别为（14.23±4.17），（3.49±1.26）％和（2.79±1.22）％。经统计发现，pBp-PTEN-BIU87细胞的细胞凋亡率明显高于其它两对照组（P＜0.05）。此外，pBp-PTEN-BIU87细胞处于细胞周期G0-G1期的细胞数目明显多于其它两组（P＜0.01）。而处于S期的细胞数目明显少于其它两组（P＜0.01），这说明PTEN对肿瘤细胞产生G1-S阻滞作用。结论转染PTEN后，BIU-87肿瘤细胞的细胞凋亡明显增加。这提示，PTEN基因能够诱导和促进膀胱癌细胞BIU-87的凋亡，从而达到抑制肿瘤发生、发展的目地，而以PTEN为靶点的基因治疗有其可行性。第三部分PTEN基因转染对人膀胱癌细胞系BIU-87化疗敏感性的影响及对裸鼠移植瘤的作用目的研究抑癌基因PTEN转染对人膀胱癌细胞系BIU-87化疗敏感性的影响及对裸鼠移植瘤的治疗作用。方法将携有PTEN基因的重组真核表达质粒pBp-PTEN转化大肠杆菌DH5α并扩增，抽提纯化质粒并进行酶切鉴定，pBp-PTEN体外转染BIU-87细胞（pBp-PTEN-BIU87），筛选稳定转染的细胞并扩增培养，以转染了空质粒pBp的BIU-87细胞（pBp-BIU87）和正常BIU-87细胞为对照，用RT-PCR检测PTEN的表达情况，应用MTT分别研究转染前、后膀胱癌细胞对不同浓度抗癌药物丝裂霉素MMC（1μg／ml、10μg／ml和100μg／ml）、康朴赛星（0.25μg／ml、2.5μg／ml和25μg／ml）和吡柔比星（2μg／ml、20μg／ml和200μg／ml）的抑制率和敏感性的变化。抗癌药物浓度根椐临床血浆峰值浓度（PPC）的0.1倍，1.0倍和10倍的剂量进行。药物抑制率=（对照组吸光度-实验组吸光度）／对照组吸光度×100％，抑制率＜25％，表示细胞对药物不敏感，25％≤抑制率＜50％，表示细胞对药物敏感，50％≤抑制率＜75％，表示细胞对药物中度敏感，抑制率≥75％，表示细胞对药物高度敏感。在瘤鼠移植瘤内多点注射pBp-PTEN，定期观察肿瘤体积变化，以了解PTEN对肿瘤的抑制作用。结果RT-PCR证实PTEN在转染的BIU-87细胞中能稳定表达。PTEN转染后，BIU 87细胞对MMC的药物抑制率和敏感性明显提高，对吡柔比星和康朴赛星的药物抑制率和敏感性无明显变化；pBp-PTEN肿瘤局部注射后2周，肿块体积与对照组比较无明显差异。结论PTEN基因转染能提高人膀胱癌细胞系BIU-87对某些抗癌药物的敏感性，作用的强弱取决于药物的作用机制。癌基因PTEN的作用是使肿瘤细胞发生G1-S期阻滞，故G1期细胞数目增多，S期细胞数目减少。MMC主要作用于G1期的肿瘤细胞，能与DNA双链交叉联结，导致DNA复制抑制，故二者有协同作用；康朴赛星属于羟基喜树碱，主要作用于S期，对拓扑异沟酶I有抑制作用，故与PTEN产生互相削弱的作用；吡柔比星以称吡喃阿霉素，主要作用是在G2期和S期嵌入DNA双键和抑制DNA聚合酶来抑制肿瘤细胞，使细胞周期中止于G2期，故与PTEN也无协同作用。因此我们可以说，PTEN基因转染能提高人膀胱癌细胞系BIU-87对某些抗癌药物的敏感性，但作用的强弱取决于药物的作用机制。第四部分PTEN基因对人膀胱癌细胞BIU-87中PI3K-Akt信号通路的作用目的PI3K-Akt途径是蛋白激酶偶联受体介导的一条重要的信号转导通路。细胞外信号分子如生长因子结合受体后磷酸化PI3K，活化后的PI3K通过对膜脂质和PIP₂的磷酸化反应产生PIP₃，PIP₃是细胞生长调控中重要的信号分子，它结合Akt并使之定位于胞膜，Akt发生构象改变，易于被磷酸化激活。Akt是一种高度保守的蛋白质丝氨酸／苏氨酸磷酸化激酶，被认为是原癌基因之一，通过对凋亡调控蛋白的磷酸化而抑制细胞的凋亡。活化的Akt作用于其下游底物，促进细胞的增殖，抑制凋亡并对细胞周期起正调控作用。本实验研究抑癌基因PTEN转染对人膀胱癌细胞BIU-87中PI3K-Akt信号通路的作用。方法将携有PTEN基因的重组真核表达质粒pBp-PTEN转化大肠杆菌DH5α并扩增，抽提纯化质粒并进行酶切鉴定，pBp-PTEN体外转染BIU-87细胞（pBp-PTEN-BIU87），筛选稳定转染的细胞并扩增培养，以转染了空质粒pBp的BIU-87细胞（pBp-BIU87）和正常BIU-87细胞为对照，用RT-PCR检测PTEN的表达情况。将PTEN基因的真核表达质粒转染膀胱癌细胞BIU-87（pBp-PTEN-BIU87），以BIU87细胞和pBp-BIU87细胞为对照，应用Wester blot方法检测三组细胞P110（PI3K的催化亚单位）、磷酸化P110、Akt和磷酸化Akt表达的情况。结果 3种细胞P110和Akt蛋白总水平没有变化，但磷酸化P110和磷酸化Akt在PTEN转染细胞中的表达明显弱于对照组。结论 PTEN通过它的脂质磷酸酶作用负性调节PI3K-Akt信号通路，降低PI3K和Akt的磷酸化水平，阻断癌基因Akt的激活，抑制Akt及其下游激酶的活性，抑制细胞增殖，促进细胞的凋亡，从而抑制肿瘤的发生发展，也就是说PTEN是通过对PI3K-Akt信号传导途径的负调控而抑制肿瘤形成的。PTEN-PI3K-Akt途径可能是PTEN抑癌作用的重要机制。