长春花作为一种药用植物,能够产生超过130种萜类吲哚生物碱,包含目前应用最广泛的抗肿瘤药物长春碱和长春新碱。但是,这些萜类吲哚生物碱分布于长春花的不同组织器官中,因结构复杂导致合成难度大,因此目前这类化合物的生产主要以植物提取为主。茉莉酸作为一种植物激素,在植物体内广泛存在,是植物的生长调节物质。在植物中,茉莉酸类物质可以作为调节信号,通过包括积累次生代谢产物等生理生化过程,调节植物的防御应答反应。茉莉酸及其衍生物能够影响生物体内多个基因的表达,从而影响植物次生代谢产物的积累。因此,对于长春花中的茉莉酸信号通路的研究至关重要。在茉莉酸信号通路中,茉莉酸能够在茉莉酸-异亮氨酸合成酶JAR1的催化下生成茉莉酸-异亮氨酸,而后茉莉酸-异亮氨酸与受体分子COI1结合,进而激活信号通路。因此,受体分子COI1和JA-Ile合酶是茉莉酸信号通路的关键元件。在本实验室的前期研究中发现,当过表达长春花中的受体分子COI1以及JA-Ile合酶的编码基因CrCOI1和CrJAR1,能够强化茉莉酸-异亮氨酸和受体分子COI1之间的相互作用,进而激活茉莉酸信号通路,促进了长春质碱和文多灵的积累。为了研究CrCOI1和CrJAR1对长春花生物碱合成调控的影响,在本论文中,我们利用生物信息学手段,分析了长春花CrJAR1和CrCOI1基因序列;利用病毒诱导的基因沉默技术,沉默长春花叶片中CrJAR1和CrCOI1的表达,通过高效液相色谱分析长春花叶片中长春质碱和文多灵的含量,通过实时定量PCR分析长春质碱和文多灵合成途径中关键酶基因的表达情况。其具体结果如下:首先构建重组质粒,并通过生物信息学分析CrCOI1和CrJAR1序列,预测了CrCOI1和CrJAR1蛋白的分子量、等电点、分子式等,同时预测该蛋白可能定位于细胞质中。通过构建CrCOI1和CrJAR1蛋白的系统进化树,发现CrCOI1蛋白与番薯和辣椒的COI1蛋白的亲缘关系较近,而CrJAR1蛋白与笋瓜和番木瓜的JAR1蛋白的亲缘关系较近。对二级、三级结构预测发现,CrCOI1和CrJAR1蛋白主要由α-螺旋构成。然后,利用病毒诱导的基因沉默技术,成功沉默长春花叶片中CrCOI1和CrJAR1基因的表达,并利用HPLC检测侵染后的长春花叶片中长春质碱和文多灵的含量。结果发现,与对照组相比,实验组中长春质碱的积累量降低了3倍,而文多灵的积累量降低了2倍,这表明沉默CrCOI1和CrJAR1基因会抑制长春花中长春质碱和文多灵的积累。同时,利用实时定量PCR分析长春质碱和文多灵合成途径中关键酶基因的表达,发现,与对照组相比,长春质碱与文多灵合成途径的关键酶基因的表达量均显著降低;且在同时沉默CrJAR1、CrCOI1基因时,CrTDC下调10倍左右,其余基因均下调20倍左右,这表明沉默CrJAR1、CrCOI1基因会对抑制长春质碱与文多灵合成途径的关键酶基因的表达。外源Me JA处理6 h,长春质碱与文多灵合成途径的关键酶基因的相对表达量随着处理时间的增加而提高,且在对照组中上升趋势最为明显,而在同时沉默CrJAR1、CrCOI1基因时,上升趋势最为缓慢。上述结果表明,沉默CrJAR1基因会降低JA-Ile的合成,沉默CrCOI1基因则会减少受体分子COI1蛋白的积累,而同时沉默CrCOI1、CrJAR1基因会减弱茉莉酸-异亮氨酸与受体分子COI1的相互作用,进而抑制JA信号通路的信号传导,降低了长春质碱以及文多灵合成途径中关键酶基因的表达,最终导致生物碱合成的降低。本研究为进一步研究受体分子COI1以及JA-Ile合酶对长春花生物碱合成调控的提供依据,并为后续研究其功能奠定基础。