猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）自上世纪90年代报道以来，给世界养猪业造成了严重的经济损失。由于该病的病原PRRSV遗传变异快、并且能够导致被感染猪群出现持续性感染和免疫抑制现象，因而受到研究人员的极大关注。随着PRRS疫苗的普遍应用，对预防和控制该病的流行发挥了重要作用。但是在免疫压力的作用下，一些新的高致病性PRRSV变异毒株又陆续出现。为了揭开PRRSV的神秘面纱，研究人员在PRRSV对宿主的致病机理与免疫机制等方面做了大量的研究，但是对于PRRSV病原本身的转录复制特性与致病的相关性尚未得到解析和阐明。因此，我们有必要从病毒的复制转录机制入手，分析PRRSV如何通过连续转录和不连续转录调控基因组RNA和亚基因组RNA合成之间的平衡，挖掘其转录调节因子和具体机制。　　为了建立PRRSV N蛋白的Western blot检测方法，本研究利用冷休克表达载体pCold-I成功表达了PRRSV N蛋白。原核表达的蛋白经纯化和免疫BALB/c小鼠后，对PRRSV N蛋白进行Western blot和IFA检测。结果发现，本研究制备的多克隆抗体具有良好的免疫反应性和特异性，为本研究提供了坚实的实验基础。　　蛋白（N蛋白）的磷酸化修饰现象是套式病毒的共同特征之一。为建立N蛋白磷酸化位点鉴定方法，本研究利用Phos-tag技术成功实现了N蛋白磷酸化与非磷酸形式的分离。经Phos-tagSDS-PAGE凝胶电泳后，真核表达或者病毒本身的N蛋白能够出现2条特异性条带。运用免疫沉淀方法纯化和富集N-HA蛋白后，经牛小肠碱性磷酸酶（Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP）处理后，N蛋白的磷酸化条带消失，说明N蛋白的磷酸化位点可能仅有1个。随后利用定点突变技术对N蛋白真核表达载体的丝氨酸位点进行单个突变或者利用基因合成方法将N蛋白的所有丝氨酸位点替换为丙氨酸作为阴性对照。结果发现，Ser120突变后，N蛋白的磷酸化形式消失，与阴性对照一致。说明PRRSVN蛋白的磷酸化位点为蛋白C末端的第120位丝氨酸。　　为了进一步研究N蛋白磷酸化对于病毒复制的影响，本研究采用反向遗传学方法，对PRRSV感染性cDNA克隆进行N蛋白磷酸化位点突变并成功拯救了病毒。结果发现，突变病毒在致细胞病变、空斑形态及N蛋白的亚细胞定位等均没有明显差异。而病毒的复制能力却稍微下降，多步生长曲线结果表明，在感染后的24-72 h，突变毒的复制水平比亲本毒低一个滴度左右。利用荧光定量方法检测亲本病毒与突变病毒在不同时间的基因组RNA和亚基因组RNA的转录水平，检测结果发现，在病毒感染的早期，突变毒的基因组RNA和长链亚基因组RNA的合成水平明显低于亲本毒，而突变毒的短链sgRNA却比亲本毒略高。这表明N蛋白的磷酸化对于病毒的感染性不是必需的，但是对病毒基因组RNA和亚基因组RNA的转录水平具有调控作用。　　PRRSV N蛋白不仅能够磷酸化，而且还能够与许多的宿主蛋白相互作用。为了探究N蛋白与宿主蛋白相互作用对病毒复制和转录的影响，本研究通过免疫共沉淀实验发现，PRRSV N蛋白能够与宿主细胞的RNA解旋酶DDX5相互作用，并且主要的相互作用部位处于病毒复制的细胞质。进一步利用截短表达实验发现，DDX5与N蛋白之间的相互作用部位为N-N端连接，这种连接作用不需要RNA的介导作用，但是RNA的存在有利于两种蛋白的结合。利用siRNA干扰方法发现，沉默宿主DDX5蛋白表达能够促进病毒的复制。进一步的研究发现，在病毒感染12 h后，病毒基因组RNA和长链亚基因组RNA的合成水平明显高于对照组，而短链亚基因组RNA没有明显区别。这一结果表明，DDX5在病毒复制过程具有负调控病毒长链RNA的转录过程。