一、研究背景与目的哮喘是一种慢性炎症性肺部疾病,其特征为过敏原气道高反应性、气道重塑和粘液分泌增多。Th2细胞在气道反应中起着主要调控功能,其分泌的细胞因子如IL-4,IL-5和IL-13在哮喘的病理生理过程中起着关键的作用,同时它也参与条件激活性巨噬细胞（M2）的极性调控。这类巨噬细胞能产生各种促炎因子,如趋化因子、FIZZ（又称为抵抗素样分子α,Relm-α）等,这些因子能够促进哮喘炎症反应和气道重塑。M2型巨噬细胞的标志物的表达量与人和小鼠的过敏性气道疾病的严重性呈正相关,揭示了 M2型巨噬细胞加速了病情的发生发展。M1型巨噬细胞由人和小鼠干扰素（IFN）-γ和脂多糖（LPS）诱导极化而来。这类细胞释放炎症因子（IL-12、IL-6、TNF-α等）和趋化因子（CXCL10、CCL3等）来产生高浓度的氮氧化合物,在抵抗细胞内病原物方面起着很重要的保护作用。总而言之,巨噬细胞的极化状态在过敏性哮喘中起着关键的作用,然而,M2型巨噬细胞如何诱导Th2细胞应答的具体机制还不清楚。Rheb（ras homolog enriched in brain）属于ras GTP酶的超家族,在体内有两种存在方式,与GDP结合的方式（GDP-Rheb）和与GTP结合的方式（GTP-Rheb）,后者才具有相应的生物学活性。Rheb不仅仅是生物发育所必需的信号蛋白,也是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mechanistic target of rapamycin complex 1,mTORC1）的有效激活剂。Rheb蛋白家族有两种成员,分别为Rheb1与Rheb2,它们都是在哺乳动物里发现,其中Rheb1在小鼠体内发挥着主要的功能,而且似乎主要调控着mTORC1的活性。Rheb1能够直接与mTOR有激酶活性结构域结合,但是Rheb1基因的核苷酸如果发生缺失导致突变,就会失去其催化活性而处于失活状态。然而,即使带有GTP酶活性的Rheb1没有直接与mTOR结合,而是与 FKBP38（FK506-binding protein 38）或者 PLD1（phospholipase D1）结合,同样可以促进mTOR活化。在mTORC1信号通路中,Rheb1的功能受到其上游结节性硬化复合物1（TSC1）和结节性硬化复合物2（TSC2）（TSC1/TSC2）异二聚体的抑制作用。近年有研究报道,TSC可调节巨噬细胞极化。巨噬细胞特异性敲除TSC1的小鼠（mTORC1活化）在过敏性哮喘中对M2型巨噬细胞极化具有很大的抵抗功能,而且TSC1可通过mTOR依赖性或非依赖性信号通路调节巨噬细胞极化。然而,Rheb1在调节过敏性哮喘中的作用机制和巨噬细胞的极性关系目前仍然不清楚,有待进一步研究。在本课题研究中,我们首先发现OVA诱导过敏性哮喘炎症的C57小鼠巨噬细胞Rheb1表达和mTORC1活性均增加。因此,我们接着利用巨噬细胞特异性敲除Rheb1小鼠模型来研究OVA诱导过敏性哮喘中Rheb1的作用及其细胞和分子机制。二、研究方法1、基因敲除小鼠的繁殖与构建。将Lys-MCre小鼠与Rheb1flox/flox小鼠交配产生Lys-MCre,Rheb1flox/+及Rheb1flox/+小鼠,产生的 Lys-MCre,Rheb1flox/+的小鼠与Rheb1flox/flox小鼠回交后得到的Lys-MCre,Rheb1flox/flox小鼠作为敲除鼠,同窝出生不带Cre的Rheb1flox/flox及Rheb1flox/+小鼠作为野生型鼠。2、OVA诱导过敏性哮喘小鼠模型的建立。挑选体重在20g左右的个体,平均分为2个组:生理盐水造模组（对照组）和OVA造模组（实验组）。首先我们在第1天和第7天给予实验组腹腔注射致敏剂,每只小鼠注射0.2ml,而对照组则在第1天和第7天腹腔注射生理盐水,每只小鼠注射0.2ml。随后从第24天到第30天,我们给予实验组进行雾化实验,让小鼠处于密闭的环境中吸入雾化的致敏剂（2%OVA）,同样地,对照组用生理盐水雾化,每天雾化30min。3、检测小鼠气道高反应性。小鼠放于体描箱后等待约十分钟让其安静和适应环境,然后进行实验。依次雾化生理盐水和浓度梯度上升的乙酰甲胆碱（6.25mg/ml、12.5mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml）。每次雾化后进行 3 分钟的数据记录。气道反应性以雾化不同浓度MCh所得的Penh值与雾化生理盐水所得的Penh值的比值表示。4、利用组织切片免疫组化及免疫荧光了解小鼠肺组织PS6表达,判断其mTORC1的活性,了解小鼠肺组织F4/80、iNOS和CD206表达,判断其巨噬细胞炎症浸润情况。此外,通过免疫印迹来确定与mTORC1活性相关的蛋白的表达水平。同时利用Trizol试剂提取肺泡组织mRNA来进行IL-1 β及IL-6等因子的转录水平测定,了解小鼠的炎症相关因子的转录水平改变。三、研究结果1、OVA诱导的过敏性炎症促进小鼠肺泡炎症细胞mTORC1和Rheb1活化。OVA造模后,我们发现实验组Rheb1的表达量是对照组的1.7倍。另外我们再看PS6（s235/236）表达情况,分析发现实验组PS6（s235/236）的表达量是对照组的3.2倍。说明实验组的Rheb1和PS6（s235/236）表达量较对照组多。因此,我们初步得出的结论是:OVA诱导的过敏性炎症能促进小鼠肺泡炎症细胞mTORC1的活化与Rheb1表达。表明mTORC1与Rheb1在调节过敏性炎症方面起着关键的作用。2、巨噬细胞特异性敲除Rheb1加剧OVA诱导过敏性炎症的发生。（1）气道高反应性检测结果表明,两组小鼠数据的Penh值出现明显的差异（P<0.05）,其中实验组的敲除小鼠比野生型小鼠升高,而对照组的敲除小鼠与野生型小鼠并没有明显的差异（P>0.05）。（2）瑞氏染色结果显示,实验组小鼠的总炎症细胞比对照组的数量多。此外,实验组的敲除小鼠的嗜酸性粒细胞与中性粒细胞的数量较野生型小鼠要多。（3）HE染色结果显示,在OVA造模后,小鼠的肺组织出现了典型的炎症病理学特征,而生理盐水组的肺组织并没有出现明显特征,而在OVA造模中,敲除小鼠比野生型小鼠出现更明显的炎症特征。（4）PAS糖原染色结果显示,在OVA造模后,小鼠的肺组织出现了严重的炎症细胞浸润,而生理盐水组的肺组织并没有出现其特征,在OVA造模中,敲除小鼠的炎症细胞浸润等级最高。（5）免疫组化结果显示,在OVA造模后,小鼠的肺组织高表达α-SMA和Muc5ac蛋白,而生理盐水组的肺组织并没有出现其特征,在OVA造模中,敲除小鼠的肺组织表达α-SMA和Muc5ac蛋白比野生型小鼠要高很多。以上的结果都说明,在OVA诱导的过敏性炎症过程中,小鼠出现了严重的肺泡炎症反应,炎症细胞大量地浸润到肺组织并出现病理特征。而巨噬细胞敲除了 Rheb1基因之后,更加剧了肺部炎症的病情,出现的肺泡炎症反应更加明显。3、巨噬细胞特异性敲除Rheb1在过敏性炎症中诱导Th2细胞因子而抑制Th1细胞因子表达。（1）小鼠血清ELISA结果显示,OVA造模的小鼠血清中所表达的Th1和Th2细胞因子比生理盐水组小鼠要高很多。此外,在OVA造模中,基因敲除小鼠的Th1细胞因子表达量低于野生型小鼠,而Th2细胞因子表达量却高于野生型小鼠。（2）肺泡灌洗液ELISA结果显示,OVA造模的小鼠肺泡灌洗液中所表达的Th1和Th2细胞因子比生理盐水组小鼠要高很多。此外,在OVA造模中,基因敲除小鼠的Th1细胞因子表达量低于野生型小鼠,而Th2细胞因子表达量却高于野生型小鼠。以上的结果都说明,巨噬细胞特异性敲除Rheb1在过敏性炎症中增加了 Th2细胞因子的表达,而Th1细胞因子的表达量降低了。4、巨噬细胞特异性敲除Rheb1增加M2型巨噬细胞极化而抑制M1型巨噬细胞。（1）mRNA检测结果显示,Rheb1敲除的巨噬细胞TNF-α、iNOS和IL-6的mRNA表达水平比野生型小鼠低很多,而Arg1、CD206、Fizz1和Ym1的mRNA表达水平比野生型小鼠高。说明巨噬细胞特异性敲除Rheb1的巨噬细胞会倾向M2型极化,而降低巨噬细胞向M1型极化。（2）流式细胞分析结果显示,Rheb1敲除的小鼠骨髓巨噬细胞表达F4/80、CD206双阳性的细胞/总细胞百分率是37.72%,野生型小鼠双阳性细胞/总细胞百分率是12.03%,敲除小鼠的表达量比野生型小鼠高。结果表明,巨噬细胞特异性敲除Rheb1的巨噬细胞M2型极化得更多。5、巨噬细胞特异性敲除Rheb1在过敏性炎症中增加M2型巨噬细胞极化而抑制M1型巨噬细胞。（1）mRNA结果显示,在对照组的细胞中,敲除小鼠的Arg1、Fizz1、IL-10和Ym1表达量比野生型小鼠高,而在OVA造模组的细胞中,敲除小鼠的M2标志物的表达量与野生型小鼠出现更加明显的差异。结果表明,在两种造模的小鼠中,敲除小鼠极化的M2型巨噬细胞均比野生型小鼠要多,而且OVA造模比生理盐水造模的差异更加明显。（2）免疫荧光结果显示,在两种造模的小鼠中,敲除小鼠的F4/80和CD206阳性均比野生型小鼠多,而且OVA造模比生理盐水造模的差异更加明显。（3）mRNA结果显示,在生理盐水造模组的细胞中,敲除小鼠的IL-6、iNOS和TNF-α的mRNA表达量比野生型小鼠低,而在OVA造模组的细胞中,敲除小鼠的M1标志物的表达量与野生型小鼠出现更加明显的差异。结果表明,在两种造模的小鼠中,敲除组极化的M1型巨噬细胞均比野生型小鼠要少,而且OVA造模比生理盐水造模的差异更加明显。（4）同样,免疫荧光结果显示,在两种造模的小鼠中,敲除小鼠的F4/80和iNOS阳性均比野生型小鼠少,而且OVA造模比生理盐水造模的差异更加明显。以上的结果均表明,巨噬细胞特异性敲除Rheb1在过敏性炎症中增加M2型巨噬细胞极化而抑制M1型巨噬细胞。四、结论1、OVA诱导的过敏性炎症促进小鼠肺泡炎症细胞mTORC1和Rheb1活化2、巨噬细胞特异性敲除Rheb1加剧OVA诱导过敏性炎症的发生3、巨噬细胞特异性敲除Rheb1在过敏性炎症中诱导Th2细胞因子而抑制Th1细胞因子表达4、巨噬细胞特异性敲除Rheb1增加M2型巨噬细胞极化而抑制M1型巨噬细胞5、巨噬细胞特异性敲除Rheb1在过敏性炎症中增加M2型巨噬细胞极化而抑制M1型巨噬细胞