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鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infections bursal diseas virus,IBDV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。IBDV在入侵宿主后迅速复制致使B淋巴细胞大量坏死和凋亡,导致鸡的免疫功能受到严重损伤,造成被感染家禽严重的免疫抑制。传染性法氏囊病的发生过程,是宿主与病原多层面作用的复杂过程,目前IBD致病的分子机制并不十分清楚。本研究拟以IBDV感染DT40细胞和非免疫鸡胚,通过对线粒体代谢动力学和能量水平的检测,从代谢层面上揭示IBDV感染细胞的线粒体生物氧化与致病性的关系;通过表达IBDV-VP4蛋白对脂酰CoA转运的影响,从分子层面探讨VP4蛋白分子拟态对线粒体呼吸链能量代谢的影响。1、IBDV感染对B淋巴细胞线粒体能量代谢的影响为研究IBDV感染对宿主免疫细胞线粒体代谢的影响,本实验以IBDV分离株感染DT40细胞,分别于病毒感染后24 h、48 h、72 h和96 h取样,细胞计数并分离细胞线粒体,通过检测线粒体蛋白含量,线粒体膜电位,肉碱脂酰转移酶和NADH-CoQ还原酶活性,ATP水平,线粒体脂酰-CoA和NADH、NAD+的含量及NADH/NAD+比值,初步评估IBDV感染对宿主细胞线粒体生物氧化的影响。结果表明,IBDV感染DT40细胞48 h后,线粒体蛋白含量显著降低(P<0.01),膜电位下降,肉碱脂酰转移酶和NADH-CoQ还原酶活性在感染后24 h开始下降(P<0.05),48 h后显著降低(P<0.01);脂酰-CoA和ATP含量在感染后48 h后显著降低(P<0.01),NADH/NAD+比值显著增高(P<0.01)。说明IBDV感染DT40细胞后不但对线粒体造成了损伤,而且脂酰CoA的转运和NADH呼吸链受到抑制,导致线粒体能量代谢障碍。本实验从代谢角度为进一步探索IBDV感染对鸡细胞的致病机理提供依据。2、IBDV感染对鸡胚肝脏细胞线粒体能量代谢的影响为了进一步研究IBDV感染对宿主线粒体能量代谢的影响和从代谢方面揭示致病机制,本研究通过用IBDV毒株感染鸡胚,通过传代培养,分离肝脏细胞线粒体,测定线粒体蛋白含量及线粒体呼吸链相关酶活性。结果表明,IBDV感染鸡胚后,在传代初期线粒体蛋白和ATP含量显著降低(P<0.01),肉碱脂酰转移酶和NADH-Co Q还原酶活性显著下降(P<0.01);脂酰-CoA和ATP含量在感染后先显著降低(P<0.01);随着传代和鸡胚适应,线粒体蛋白、ATP含量、肉碱脂酰转移酶、NADH-Co Q还原酶活性以及脂酰-CoA逐渐升高,NADH/NAD+比值较传代初期降低(P<0.05)。比较而言,传代初期丙酮酸水平显著降低(P<0.01),乳酸升高(P<0.01),糖酵解途径有加强趋势,但细胞总ATP含量降低。实验从机体层面证明了感染IBDV后,可以引起线粒体功能的缺陷,导致能量代谢的紊乱,影响鸡胚的正常生长以至死亡。3、IBDV-VP4蛋白真核表达载体的构建和表达及其对DT40细胞线粒体能量代谢的影响为研究IBDV VP4蛋白与肉碱脂酰转移酶结构拟态对脂酰-CoA转运和NADH-CoQ还原酶及线粒体能量代谢的关系,本实验通过扩增IBDV-VP4基因,构建真核表达载体pcDNA3.0-VP4并转染DT40细胞,通过对VP4蛋白表达和线粒体进行能量代谢检测,发现在转染48 h后脂酰-CoA和ATP含量显著升高(P<0.01),肉碱脂酰转移酶活性在转染后72 h达到最高水平(P<0.01);NADH/NAD+比值在48 h时显著升高(P<0.01),转染中后期NADH-CoQ还原酶活性降低,ATP含量有所下降,表明VP4蛋白对线粒体呼吸链起始价段就产生了抑制作用;转染早期丙酮酸显著降低(P<0.01),乳酸升高(P<0.01),糖酵解加强。为从分子层次上研究IBDV感染细胞的致病机理与线粒体能量代谢的生物氧化的关系奠定了基础。