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目的:借助R语言数据挖掘探讨黄芪类方补阳还五汤的组方配伍规律,通过网络药理学预测分析及体内外实验验证,探讨补阳还五汤对糖尿病脑病的防治作用机制。方法:1.查询《伤寒杂病论》《千金要方》《千金翼方》《脾胃论》《内外伤辨惑论》《兰室秘藏》等书中含有黄芪的方剂建立黄芪类方数据库,以《中国药典》为标准规范药物名称。运用R语言对数据进行统计分析,使用item Frequency函数对数据进行频次分析,corrplot函数对数据进行相关分析,extrafont函数进行可视化。使用arules、arules Viz函数进行关联规则分析,通过Q、R型聚类对药物及类方进行聚类分析。2.利用TCMSP、TCMID数据库检索补阳还五汤的化学成分及成分所对应的蛋白靶点,借助uniprot数据库进行补阳还五汤药物蛋白靶点与靶基因互换;检索disgenet数据库查找糖尿病脑病的靶基因。利用Cytoscape3.8.0软件构建中药-成分-靶点网络图,借助Venny2.1绘制药物靶基因与疾病靶基因交汇的韦恩图。借助STRING数据库,构建药物靶点与疾病靶点的蛋白交互网络。通过DAVID6.8数据库进行GO、KEGG分析。3.体外实验:采用高糖诱导PC12细胞损伤构建糖尿病脑病体外模型,使用CCK-8法检测补阳还五汤对PC12的细胞毒性及对HG-PC12细胞活力的影响,明确补阳还五汤的给药剂量。采用流式细胞术检测补阳还五汤干预HG-PC12的细胞凋亡情况。Western blot法检测PC12细胞Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、Caspase-3蛋白及PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达水平。4.体内实验:高脂高糖饮食喂养SD大鼠4周,联合小剂量STZ腹腔注射构建T2DM大鼠模型。实验分为模型组、补阳还五汤高、中、低剂量组和二甲双胍组,每组13只;另设空白对照组10只。各组大鼠给予相应干预,定期检测体重、空腹血糖变化;于给药第8周末进行空腹葡萄糖耐量测定。药物干预8周后取材,经腹主动脉采血,分离血清。检测血清中糖化血红蛋白、血脂水平;H&E染色法观察大鼠海马组织病理形态学改变,免疫组化法检测大鼠海马组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3等蛋白表达;Western blot法检测海马组织中PI3K/AKT信号通路相关蛋白及Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、Caspase-3的表达水平。结果:1.共纳入黄芪类方295首,71%的黄芪类方含6-15味药。使用频次>100次的中药包含黄芪、当归、人参、白芍等;使用频率>30次的中药里多见补虚药,补阳还五汤含当归、赤芍等,符合黄芪类方常见用药数规律。正相关性系数药对有石斛-肉苁蓉等,负相关系数有桂枝-柴胡等。关联分析见{当归}=>{黄芪},{当归,人参}=>{黄芪},{当归,人参,生甘草}=>{黄芪}分别是2、3、4种药物关联规则中支持度最高的组合。R型聚类分析可见当归-人参最先成类,白芍-甘草成类等,均从不同角度表明补阳还五汤中黄芪配当归、芍药、川芎的补虚结构与黄芪类方组方规律相符。2.网络药理学分析获得补阳还五汤91个活性化合物,201个基因靶点;糖尿病脑病疾病靶点1148个,药物-疾病共同靶点35个,PPI蛋白交互网络筛选出关键靶点AKT1、PYGM、MPO等。GO分析中生物学过程主要有细胞对增殖的应答,凋亡信号通路调节、对药物的应答等;细胞组成主要包括细胞质膜复合物,蛋白质络合物,细胞溶质等;分子功能主要包括酶结合,DNA结合,转录因子结合等。KEGG分析发现补阳还五汤的核心作用靶点富集在PI3K/AKT信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路等。3.体外实验:(1)100m M高糖培养基处理PC12细胞48h后,细胞存活率显著降低(P<0.01)。补阳还五汤(400、600、800μg/m L)干预HG-PC12细胞,细胞活力显著增强(P<0.01),补阳还五汤浓度为800μg/m L时,细胞活力最强。(2)CCK-8结果:与高糖组相比,补阳还五汤干预HG-PC12细胞各组存活率显著增高(P<0.01)。(3)流式细胞术结果:与正常组相比,高糖诱导的PC12细胞出现早期凋亡(P<0.01);补阳还五汤各组显著改善了HG诱导的PC12细胞凋亡(P<0.01)。表明补阳还五汤能够增强PC12细胞活力,抑制HG诱导的PC12细胞损伤。(4)Western blot结果显示:与正常组相比,高糖组Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表达显著升高(P<0.01),Bax/Bcl-2比值显著增高(P<0.01);与高糖组相比,补阳还五汤高剂量组及二甲双胍组Bax、Caspase-3蛋白表达显著降低(P<0.01),补阳还五汤高剂量组Bcl-2表达明显升高;补阳还五汤低剂量组Cleaved Caspase-3蛋白表达显著降低(P<0.01)。(5)Western blot结果显示:与正常组相比,高糖组p-AKT蛋白表达明显降低(P<0.05),与高糖组相比,补阳还五汤高剂量组及二甲双胍组PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达明显升高(P<0.05)。4.体内实验:(1)与模型组相比,补阳还五汤各组大鼠体质量升高,FBG及Hb A1c明显降低(P<0.05),血清中TC、TG、LDL-C水平显著降低,HDL-C水平显著升高(P<0.05)。OGTT结果显示:与模型组相比,补阳还五汤各剂量组及二甲双胍组大鼠血糖水平显著降低(P<0.01);(2)H&E染色结果显示:与模型组相比,补阳还五汤高剂量组和二甲双胍组多数神经元细胞相对完整,细胞形态改变较轻;(3)IHC结果显示:与模型组相比,补阳还五汤各剂量组及二甲双胍组Bax、Caspase-3阳性表达显著减少(P<0.01),Bcl-2阳性表达显著增多(P<0.01);(4)Western blot结果显示:与模型组相比,补阳还五汤各剂量组及二甲双胍组Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.01),补阳还五汤高剂量组Bax蛋白表达显著降低(P<0.01);补阳还五汤高剂量组Caspase-3蛋白表达明显降低(P<0.05);补阳还五汤高剂量组及二甲双胍组Cleaved Caspase-3蛋白表达显著降低(P<0.01)。与模型组相比,补阳还五汤各剂量组PI3K蛋白表达显著升高(P<0.01),补阳还五汤高剂量组和二甲双胍组p-AKT蛋白表达明显升高(P<0.05),补阳还五汤中剂组p-PI3K蛋白表达显著升高(P<0.01)。结论:1.补阳还五汤满足黄芪类方的组方配伍规律,方中黄芪与当归、赤芍、川芎的配伍可能是较为成熟的黄芪类方补益结构。2.补阳还五汤可能通过调控PI3K/AKT在内的多条信号通路发挥对糖尿病脑病的治疗作用,其调控的核心靶点分子可能是AKT1。3.补阳还五汤能够促进PC12细胞增殖,抑制糖尿病脑病体外模型—高糖诱导的PC12细胞凋亡,其机制可能与激活PI3K-AKT/Bcl-2信号通路有关。4.补阳还五汤能够降低T2DM大鼠空腹血糖、血脂、糖化血红蛋白,抑制T2DM大鼠海马神经元凋亡,其机制可能与激活PI3K/AKT信号通路有关。