论文部分内容阅读
研究目的探究外源性高迁移率族蛋白1(High mobility group box-1 protein,HMGB1)对放疗后残存人胰腺癌细胞系(SW1990、PANC-1)增殖和转移的影响,并补充研究了外源性HMGB1对放疗后裸鼠皮下瘤增殖的影响,初步探究外源性HMGB1引起放疗后残存胰腺癌细胞增殖和转移的相关机制。研究方法(1)ELISA实验:将胰腺癌SW1990、PANC-1细胞分别接种于24孔板中,平均每孔1×105个细胞,每孔培养基定量至800μl,共10块板,待细胞贴壁后分别将实验设置:0Gy,4Gy,8Gy,10Gy以及12Gy共5组不同放疗剂量。然后分别对10块板给予相应的放疗剂量,继续培养24h后依次将0Gy,4Gy,8Gy,10Gy及12Gy 5组不同放射剂量的细胞上清提取出来,后通过ELISA检测法对不同放疗剂量下细胞上清中HMGB1的表达量进行测定,并进行数据统计分析。(2)光学显微镜拍照:将胰腺癌SW1990、PANC-1细胞分别接种于24孔板中,大概每孔约1×105个细胞,共种4块24孔板,待胰腺癌SW1990细胞贴壁后分为2组:0Gy及10Gy放射剂量进行照射;而胰腺癌Panc-1细胞贴壁后分为2组:0Gy及4Gy放射剂量进行照射。待放疗结束后继续将胰腺癌细胞放置于细胞培养箱中持续培育24h,然后对4组细胞进行换液后,采用光学显微镜(Optical Microscope,OM)分别对4组细胞进行图像采集。(3)划痕实验:将收集获得的放疗后残存的胰腺癌SW1990、PANC-1细胞系分别接种于24孔板中,计数细胞约1.5×105细胞/孔,共6块板,待放疗后残存细胞铺满整孔后进行划痕,然后用PBS冲洗3遍后,将实验分为三组:对照组(添加无血清培养基)、HMGB1组(添加含有100ng/m L HMGB1的无血清培养基)及HMGB1+EP组(添加含有100ng/m L HMGB1+100μmol EP的无血清培养基),共500μl培养基/孔,最后在光学显微镜下分别在0h,12h,24h时间点对2株细胞分别进行取样拍照。(4)CFSE实验:将收集获得的放疗后残存胰腺癌SW1990细胞悬液及放疗后残存胰腺癌Panc-1细胞悬液并分别种于9块培养皿(直径10cm)中,待放疗后残存胰腺癌细胞贴壁后,将实验共分为三组:对照组,HMGB1组及HMGB1+EP组。其中对照组在经过换液后添加3m L DMEM-F12有血清培养基继续培养;HMGB1组在经过换液后添加3m L含100ng/m L HMGB1的DMEM-F12有血清培养基继续培养;而HMGB1+EP组经过换液后添加3m L含100ng/m L HMGB1+100μmol EP的DMEM-F12有血清培养基继续培养。待3组培养皿于恒温细胞培养箱中持续培育24h后拿出进行处理,采用CFSE法分析三组处理对放疗后残存胰腺癌SW1990细胞及放疗后残存胰腺癌PANC-1细胞增殖的影响。(5)蛋白质印记法(Western Blotting,WB)检测:将收集获得的放疗后残存胰腺癌SW1990细胞悬液及放疗后残存胰腺癌Panc-1细胞悬液并分别种于2个培养皿(直径10cm)中,待放疗后残存胰腺癌细胞贴壁后,实验分为两组:对照组及HMGB1组。对照组残存胰腺癌细胞大皿经换液加入3m L有血清培养基;HMGB1组残存胰腺癌细胞大皿经换液后加入3m L含100ng/m L HMGB1的有血清培养基。将4组培养皿放置在恒温恒湿的细胞培养箱中持续培育24h后取出,分别提蛋白;通过蛋白质印迹法对通路蛋白GSK-3β、p-GSK,转移相关蛋白E-CA、N-CA,增殖相关蛋白Ki67以及抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白质表达情况进行测定。(6)体内实验:将胰腺癌SW1990细胞接种于9个培养皿(直径10cm)中,待细胞融合度接近100%时将细胞消化离心至无菌EP管中,然后取200μl细胞悬液注射入裸鼠皮下,从而建立裸鼠胰腺癌皮下瘤模型,待模型建好后,同时将9只裸鼠进行放疗,放疗剂量为10Gy,隔日放疗,连续3次,放疗周期结束后,将9只裸鼠共分为三组:对照组3只、HMGB1组3只及HMGB1+EP组3只。其中对照组是向裸鼠皮下瘤四周注射0.9%的生理盐水,约200μl;HMGB1组向裸鼠皮下瘤四周注射含100ng/m L HMGB1的生理盐水,约200μl;HMGB1+EP组向裸鼠皮下瘤四周注射含100ng/m L HMGB1+100μmol EP的生理盐水,约200μl。在实验过程中相隔2天用直尺测定皮下瘤的长径及宽径,从而利用公式计算皮下瘤的体积,最后并进行相关数据统计。研究结果(1)不同放疗剂量(4Gy,8Gy,10Gy及12Gy)分别处理胰腺癌SW1990、Panc-1细胞后放疗后上清中HMGB1的含量均较对照组(0Gy)增高;且放疗剂量为4Gy时胰腺癌Panc-1细胞系培养上清中HMGB1含量最高,而放疗剂量为10Gy时胰腺癌SW1990细胞系培养上清中HMGB1含量最高。(2)在正常无放疗上清培养条件下,SW1990、PANC-1呈小梭形生长;在对胰腺癌Panc-1细胞进行4Gy放射治疗以及对胰腺癌SW1990细胞进行10Gy放射治疗后,继续在放疗上清培养条件下培养,Panc-1及SW1990细胞均变大且触角增多,细胞生长速度均变快。(3)划痕实验结果显示HMGB1组放疗后残存胰腺癌细胞的迁移距离及迁移面积均较对照组及HMGB1+EP组明显增加,而HMGB1+EP(HMGB1抑制剂)组放疗后残存胰腺癌细胞的迁移距离及迁移面积则较对照组明显缩小。(4)CFSE结果显示对照组、HMGB1组及HMGB1+EP组残存胰腺癌SW1990细胞增殖率分别为:(43.6±2.1)%,(62.5±2.1)%及(33.2±1.7)%,残存胰腺癌Panc-1细胞三组增殖率分别为:(37.5±0.9)%,(49±1.4)%及(29.3±1.3)%。实验结果显示:HMGB1组的细胞增殖率明显高于其他两组,且HMGB1+EP组的增殖率则较对照组降低。(5)Western blot实验结果显示HMGB1组放疗后残存胰腺癌细胞的转移相关蛋白E-cadherin表达降低及N-cadherin表达增高;增殖相关蛋白Ki67及抗凋亡蛋白Bcl-2表达增高;且GSK-3β被激活,活化的p-GSK表达亦增高。(6)三组实验分别在放疗后的种植瘤周围皮下注射200μl 0.9%生理盐水,200μl HMGB1及200μl HMGB1+EP,结果发现瘤周注射含有EP(HMGB1抑制剂)的瘤体体积较对照组减小,结果具有统计学差异。结论放疗可以使HMGB1在放疗上清中的表达增高,而外源性HMGB1可以促进放疗后残存人胰腺癌SW1990、Panc-1细胞增殖和迁移。外源性HMGB1上调Ki67、N-CA、p-GSK及Bcl-2的表达水平,下调E-CA的表达水平。外源性HMGB1抑制剂可抑制放疗后裸鼠皮下瘤的增殖。外源性HMGB1可以促进放疗后残存人胰腺癌SW1990、PANC-1细胞转移的机制可能与Wnt通路的激活及EMT的转化有关。