论文部分内容阅读
本论文通过理性设计进化的方法(定点突变、饱和突变和多点联合突变)研究酶的活性中心位点和保守区域位点的突变对酶活力的影响，为对甘油脱水酶分子的进一步改造提供理论依据。
以PDB数据库中与本实验中K. pneumoniae甘油脱水酶同源性最高的甘油脱水酶的三维结构分子(PDB liwp)为模板，利用Swissmodel进行同源建模，同时利用prosa2003能量分析软件对相应氨基酸的替换进行能量分析，分析结果显示有17个突变酶的能量相对于原始酶降低，另外11个突变酶的能量则相对于原始酶升高。
以本实验室构建的整合有肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)甘油脱水酶基因的重组质粒pSE380—gldABC为模板，利用反向PCR对该基因进行理性分子改造，共获得28个突变子，对带有突变质粒的大肠杆菌工程菌株进行诱导表达，经镍离子亲和层析与Sephacryl S300凝胶层析纯化后，SDS—PAGE分析显示出均一的三条特异性蛋白质表达条带。测定纯化后获得的突变酶的酶学性质。结果显示：在28个突变酶中，有5个突变酶在甘油和1，2—丙二醇两种底物条件下均无酶活，以甘油为底物时，酶活力得到提高的突变酶有18个，其中T234S、A119E、1498N+Q42S+Y525W和D58Y+F60Y的比活分别提高至原始酶的5.99、5.46、5.09和4.83倍；以1，2—丙二醇为底物时，酶活力得到提高的有17个，其中，T234S、Y525F、A119E和Y525F+D58Y的比活力分别是野生酶的7.1、5.9、4.8和4.7倍。另外有14个突变酶的最适温度降低为42℃，有14个突变酶的最适pH降低，有23个突变酶对不同底物的Km值与野生酶相比都发生了不同程度的变化。