【研究背景及目的】肝纤维化（hepatic fibrosis）是慢性肝损伤的共同病理过程，以细胞外基质（extracellular matrix, ECM）过度沉积为主要特征。既往研究认为，肝星状细胞（hepaticstellate cell, HSC）增殖、活化是肝纤维化发生发展的中心环节。此外最近的研究还发现肝细胞和胆管上皮细胞可通过上皮细胞间质转型（epithelial-mesenchymal transition,EMT）向肌成纤维细胞（myofibroblasts, MFs）转化并分泌ECM，在肝纤维化进程中也发挥重要作用。有研究表明，多条信号通路与HSC的活化密切相关，包括细胞外信号调节激酶1（extracellular signal-regulated kinase1, ERK1）信号通路。ERK1是丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）家族的重要成员，能促进HSC的活化。本实验室既往研究发现，下调ERK1表达能明显抑制HSC活化并阻滞HSC、肝细胞、胆管上皮细胞的EMT进程。此外，我们的研究还发现，上调肝细胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor4α, HNF4α）的表达能抑制肝细胞EMT进程，明显缓解实验性肝纤维化并恢复肝功能。微小RNA（microRNA, miRNA）是一类长约22个核苷酸（nucleotide, nt）的内源性非编码小分子RNA，可通过完全或不完全互补结合靶信使RNA（messenger RNA,mRNA）的3′非编码区（3′-untranslated region,3′-UTR），直接降解靶mRNA或抑制靶蛋白合成，在转录后水平调控基因表达。近年来的研究发现，miRNAs的异常调节被认为是包括肝纤维化在内的多种疾病发生、发展的关键因素。我们的前期实验发现miR-21在实验性肝纤维化大鼠肝组织及活化HSC中表达上调，并在体外证实miR-21可与sprouty homologue2（SPRY2）和HNF4α的3′-UTR直接结合，激活HSC细胞ERK1通路促进HSC活化，并抑制HNF4α表达从而促进肝细胞EMT进程。TuD RNA (ToughDecoy RNA)是一种更高效、持久的microRNA抑制工具，其双链结构可同时结合两分子的miRNA，其茎环结构可抵抗胞内核酸酶的降解。拮抗miR-21TuD-RNA（TuD-RNA against miR-21, TuD-21）每条链均含一个miR-21结合序列，通过与miR-21紧密结合抑制其表达。基于以上研究，本课题利用以腺病毒为载体的TuD-21（adenovirus vector mediatedexpression of TuD-21, Ad-TuD-21）在体内下调miR-21的表达，进一步研究肝纤维化进程中miR-21对HSC ERK1通路和肝细胞EMT进程的调节机制，为肝纤维化的治疗提供新的策略。【实验方法】一、重组复制缺陷型腺病毒Ad-TuD-21的构建将化学合成的能与miR-21紧密结合、包含两个miR-21结合序列的TuD-21cDNA片段与穿梭质粒pAVsiRNA1.1经Age I、EcoR I酶酶切后连接，获得表达质粒pAVsiRNA1.1-TuD-21，并测序验证。利用AdMaxTM系统将表达质粒pAVsiRNA1.1-TuD-2与骨架质粒pBHG lox ΔE1,3Cre共转染人胚肾细胞293细胞（HEK293），在胞内包装获得沉默miR-21的重组腺病毒Ad-TuD-21。以同样方法获得仅表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的对照病毒Ad-TuD-NC。空斑形成单位（plaque forming units, pfu）代表病毒滴度。将Ad-TuD-21和Ad-TuD-NC分别感染HSC-T6细胞48h后，real time RT-PCR检测Ad-TuD-21下调miR-21表达的效应。二、下调miR-21表达治疗实验性肝纤维化雄性Sprague–Dawley（SD）大鼠28只，重180~200g，购自中国科学院上海动物实验中心，利用40%CCl4/橄榄油溶液皮下注射构建大鼠实验性肝纤维化模型。将雄性SD大鼠随机分为2组：正常对照组（4只），按2ml/kg体重皮下注射生理盐水，2次/周，共12周；CCl4诱导肝纤维化组（24只），按2ml/kg体重皮下注射40%CCl4/橄榄油溶液，2次/周，共12周。给予CCl48周后，CCl4诱导肝纤维化组再随机分为以下三组：模型（Model）组（8只）：经尾静脉给予1ml、生理盐水，2次/周，共4周；Ad-TuD-NC组（8只）和Ad-TuD-21组（8只）分别经尾静脉注射用1ml生理盐水重悬的Ad-TuD-NC（5×109pfu/只）和Ad-TuD-21（5×109pfu/只），2次/周，共4周；于第12周末麻醉、放血法处死所有大鼠。Real time RT-PCR检测miR-21及肝纤维化相关基因α-平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscle actin, α-SMA）、Ⅰ型胶原蛋白（Collagen typeⅠ, COLⅠ）、基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase2, MMP2）、MMP9和组织金属蛋白酶抑制因子-1（tissueinhibitor of metalloproteinase-1, TIMP1）的表达水平。Western blot检测肝纤维化相关基因COLⅠ、MMP2、TIMP1在蛋白的表达水平。肝组织石蜡包埋、切片后用苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin, H&E）、苦味酸-酸性品红染色（Van Gieson, VG）、Masson三色染色和天狼星红-饱和苦味酸染色（Sirius red）进行组织化学染色评价肝纤维化程度，并用Image-Pro Plus (IPP)6.0软件半定量分析纤维化面积。三、研究下调miR-21抑制肝纤维化的机制Real time RT-PCR检测HSC ERK1通路相关基因SPRY2、ERK1、核糖体蛋白S6激酶2（Ribosomal protein S6kinase2, RSK2）和α-SMA及肝细胞HNF4α、白蛋白（albumin）、EMT相关基因-上皮细胞钙粘蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（vimentin）的表达。组织标本石蜡包埋、按4μm切片，抗原修复后用5%马血清封片。免疫荧光双标法检测活化HSC标志物α-SMA与ERK1通路相关基因（SPRY2、ERK1、RSK2）表达量及位置的关系以及肝细胞标志物albumin与EMT相关基因（HNF4α、E-cadherin、vimentin）表达量及位置的关系。用两种一抗共同孵育（α-SMA与SPRY2、ERK1、RSK2；albumin与HNF4α、 E-cadherin、vimentin）过夜；次日孵育相应的荧光二抗，DAPI染核、封片。荧光显微镜下观察并拍照保存。四、统计学处理数据采用SPSS18.0统计软件包进行分析。多组间采用One-WayANOVA分析，配对资料采用配对t检验，非正态分布数据采用Mann-Whitney检验。P<0.05为具有显著性差异，P<0.01为具有非常显著性差异。【实验结果】一、成功构建高效沉默miR-21表达的重组复制缺陷型腺病毒Ad-TuD-21化学合成的大鼠TuD-21cDNA片段，经测序鉴定正确。体外连接获得表达质粒pAVsiRNA1.1-TuD-21和pAVsiRNA1.1-TuD-NC分别与骨架质粒pBHG lox ΔE1,3Cre共转染HEK293细胞进行包装获得腺病毒Ad-TuD-21和Ad-TuD-NC；2d后可见GFP表达。反复感染、冻融、收集病毒，Ad-TuD-21和Ad-TuD-NC的滴度均达到2×1010pfu/ml。Real time RT-PCR检测发现，Ad-TuD-21体外感染HSC-T6细胞后，miR-21表达下调超过90%(P<0.01)，说明病毒构建成功并能在细胞内高效表达。二、下调miR-21抑制实验性肝纤维化进程Model组和Ad-TuD-NC组肝组织H&E染色发现，肝细胞坏死、纤维间隔形成、小叶结构破坏；VG染色、Masson三色染色、天狼星红-饱和苦味酸染色均显示大量纤维疤痕，说明CCl4诱导大鼠肝纤维化模型构建成功。VG染色发现，Ad-TuD-NC组和Model组纤维化面积分别是Ad-TuD-21组的3.0倍和3.2倍（P<0.01）。Masson及天狼星红-饱和苦味酸染色结果表明，Ad-TuD-21组分别较Ad-TuD-NC组和Model组纤维化面积分别约下调57%、63%和60%、71%（P<0.01）。Real time RT-PCR检测发现，与Ad-TuD-NC组和Model组相比，Ad-TuD-21组miR-21表达明显下调（P<0.05），纤维化相关基因α-SMA分别约下调73%和74%（P<0.01）、COLⅠ分别约下调53%和48%（P<0.01）、TIMP1分别约下调52%和64%（P<0.01）；MMP2、MMP9分别约上调30%、42%和37%、38%（P<0.05）。Western blot检测Ad-TuD-21组较Ad-TuD-NC组和Model组纤维化相关基因COLⅠ、TIMP1表达减少，MMP2表达上调。三、体内下调miR-21表达促进靶基因SPRY2及HNF4α表达，降低肝纤维化中ERK1通路和EMT的活性，抑制HSC活化和肝细胞EMT进程，缓解肝纤维化病程Real time RT-PCR检测发现，与Ad-TuD-NC组和Model组比较，Ad-TuD-21组ERK1通路相关基因ERK1表达分别约下调73%和69%（P<0.01），RSK2表达分别下调47%和36%（P<0.05）；Ad-TuD-21组HNF4α表达分别上调1.73倍和1.74倍（P<0.05），albumin表达上调1.88倍和1.55倍（P<0.01），上皮细胞指标E-cadherin表达上调约1.56倍和1.73倍（P <0.01）、间质细胞表型基因vimentin表达下调49%和50%（P <0.01）。组织免疫荧光双标共定位结果显示，下调miR-21的表达后，α-SMA阳性的HSC内SPRY2表达增加，α-SMA阳性的HSC内ERK1通路相关指标ERK1、RSK2表达下调。albumin阳性的肝细胞内，HNF4α表达明显增加，上皮细胞指标E-cadherin表达上调，vimentin表达减少。【结论】一、利用AdMaxTM系统成功构建高效沉默miR-21重组复制缺陷型腺病毒Ad-TuD-21。二、体内下调miR-21表达能明显缓解实验性肝纤维化程度。三、体内下调miR-21抑制肝纤维化进程的主要机制之一是促进靶基因SPRY2及HNF4α的表达，下调HSC ERK1通路活性，从而抑制HSC活化并阻断肝细胞EMT。