【摘 要】
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脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,恶性胶质瘤生长迅速,死亡率高,特别是对不能完全切除肿瘤的患者。尽管在过去的几十年里,为了改善胶质瘤综合治疗的效果做了很大的努力,但恶性胶质瘤患者的预后情况依然严峻。所以更好的了解胶质瘤发生的分子机制,并发现与胶质瘤发病相关的基因将有利于胶质瘤靶向治疗的发展。Micro RNAs（miRNAs）是一类内源性,由19～22核苷酸组成的短小、非编码单链RNA分子
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脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,恶性胶质瘤生长迅速,死亡率高,特别是对不能完全切除肿瘤的患者。尽管在过去的几十年里,为了改善胶质瘤综合治疗的效果做了很大的努力,但恶性胶质瘤患者的预后情况依然严峻。所以更好的了解胶质瘤发生的分子机制,并发现与胶质瘤发病相关的基因将有利于胶质瘤靶向治疗的发展。Micro RNAs（miRNAs）是一类内源性,由19～22核苷酸组成的短小、非编码单链RNA分子,通过与靶基因m RNA的3`非翻译区（UTR）互补配对负调控基因的表达,导致靶基因的翻译受到抑制或降解靶基因的m RNA。近来,miRNA作为一类较新的非编码RNA,已被证实在许多生理和病理过程如癌症的调控中发挥重要作用。miRNA可通过多种机制影响肿瘤的发生发展。目前认为异常表达的miRNA参与胶质瘤的发生,并且可能作为胶质瘤的癌基因或抑癌基因。为了寻找在胶质瘤中起调节作用的miRNA,我们应用高通量的基因芯片技术检测8例胶质瘤组织和瘤旁脑组织miRNA的表达,发现胶质瘤组织中miR-433表达下降。为了进一步验证基因芯片结果,我们应用定量PCR检测12例胶质瘤组织和6例脑组织中miR-433-5p和miR-433-3p的表达水平,结果表明胶质瘤组织中miR-433-5p和miR-433-3p的表达水平较脑组织降低（P<0.05）。应用定量PCR验证5个胶质瘤细胞系（U251、U87、LN229、SNB19、LN308）中miR-433-5p和miR-433-3p的表达水平,结果显示胶质瘤细胞系中miR-433-5p和miR-433-3p相对表达量低于脑组织,且U251和U87细胞系中miR-433-5p和miR-433-3p相对表达量都较低。将U251和U87胶质瘤细胞系中miR-433-5p和miR-433-3p过表达,研究miR-433-5p和miR-433-3p对人脑胶质瘤细胞系生物学特性的影响。应用MTT法和集落形成实验检测细胞增殖,表明转染miR-433-3p模拟体后细胞增殖受到明显抑制（P<0.05）。应用Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡发现,转染miR-433-3p模拟体后细胞凋亡显著增加（P<0.05）。流式细胞仪PI染色检测细胞周期,表明转染miR-433-3p模拟体后细胞周期阻滞在G0/G1期（P<0.05）。Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力的变化,发现转染miR-433-3p模拟体后细胞侵袭和迁移能力显著降低（P<0.05）。而转染miR-433-5p模拟体后对胶质瘤细胞生物学特性没有显著影响（P>0.05）。生物信息学预测和双荧光素酶实验分析表明,cAMP反应元件结合蛋白（CREB）是miRNA-433-3p的直接靶基因（P<0.05）。用实时定量PCR和Western blot检测转染miRNA-433-3p模拟体后CREB的表达。结果显示miR-433-3p的过表达可下调CREB蛋白的表达,以及其下游靶基因PCNA,BCL2,Cyclin D1,MMP-9的表达（P<0.05）。构建U87裸鼠皮下荷瘤模型,用miR-433-3p模拟体进行肿瘤的体内治疗,发现过表达miR-433-3p可抑制移植瘤的体内生长（P<0.05）。应用免疫组化染色发现miR-433-3p模拟体治疗组肿瘤标本中CREB蛋白表达较无义序列组显著降低（P<0.05）。综上所述,本研究分别从体内和体外水平对miR-433-3p的抑瘤效果进行了验证,结果显示miR-433-3p可抑制胶质瘤细胞的增殖,侵袭和迁移能力,促进细胞凋亡,并可抑制裸鼠体内瘤块的生长,其可能机制是通过抑制胶质瘤细胞中CREB的表达而发挥上述作用的。这些结果表明miR-433-3p的低表达与胶质瘤的恶性进展相关,因此,miR-433-3p可能是脑胶质瘤的一个潜在治疗靶点。
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