研究背景:人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）感染常引起神经系统疾病,严重时可危及生命。HIV-1包膜糖蛋白120（Glycoprotein-120,gp120）主要使病毒包膜与宿主细胞相应的细胞表面受体,包括T淋巴细胞的CD4、B7分子和趋化因子受体复合物相结合,通过巨噬细胞和小胶质细胞产生炎性细胞因子和类花生酸类物质等来损害神经元和干扰神经递质功能。HIV感染神经系统导致周围神经发生病理改变,而原发病变部位可能在背根神经节。研究表明HIV包膜糖蛋白gp120可直接刺激初级传入神经元而引起痛觉过敏。HIV感染并发神经病理痛的发病率较高、机理尚不清楚、治疗极为困难。DRG神经元细胞的P2X3受体及DRG卫星胶质细胞的P2X4受体与神经病理痛密切相关,并涉及炎症及免疫反应。因此,P2X3及P2X4受体可能参与HIV感染并发神经病理痛。姜黄中提取的姜黄素具有抗炎和抗肿瘤作用。纳米粒包裹可以提高姜黄素的水溶性、靶向性和生物利用度。目前尚无姜黄素纳米粒对P2X3受体介导HIV相关神经病理痛作用的研究报导。传统治疗疼痛的方法主要是针对神经元,但研究表明作用（如调节脊髓神经元的活性）于中枢神经系统的胶质细胞（小胶质细胞和星形胶质细胞）,可明显影响慢性疼痛的病理变化。因此,目前大部分病理疼痛治疗失败的原因可能是由于它的靶标是神经元。新近的研究表明神经胶质细胞可能是慢性疼痛防治的更合适靶标。损伤及伤害性剌激使受损细胞、应激细胞以及感觉神经末梢释放大量ATP,ATP在痛觉及相关伤害性信息传递中具有重要作用。卫星胶质细胞中P2X4受体为应答大量释放的ATP而参与激发炎症反应。目前尚不清楚背根神经节卫星胶质细胞中P2X4受体参与gp120介导细胞损伤的作用及可能机制。第一部分:纳米载体姜黄素对大鼠背根神经节P2X3受体介导HIV-gp120相关神经病理痛的作用研究目的:本研究通过建立HIV gp120诱发神经病理痛动物模型。在动物水平,旨在观察姜黄素纳米粒对HIV-1 gp120诱发神经病理痛模型大鼠DRG中P2X3的表达变化,观察姜黄素纳米粒是否产生改善P2X3受体介导的HIV-相关神经病理痛的作用及其可能机制。方法:本研究应用gp120诱发坐骨神经损伤模型,探究gp120相关神经病理痛的作用机制及应用姜黄素纳米粒对P2X3受体介导的HIV-相关的神经病理的作用及其可能机制。动物实验共分两个部分。第一个部分的分组为:正常组（control）、假手术组（sham）、gp120模型组（gp120）、gp120+纳米空载处理组（gp120+nano carrier）、gp120+纳米载体姜黄素处理组（gp120+nano curcumin）;第二个部分的分组为:正常组（control）、gp120模型组（gp120）、gp120+纳米载体姜黄素处理组（gp120+nano curcumin）、gp120+特异性拮抗剂A-317491处理组（gp120+A-317491）。实验内容:（1）行为学测定（分别测定各组大鼠的机械缩足反射阈值和热缩足反射潜伏期）。（2）实时定量PCR（Real-time PCR）方法检测各组大鼠背根神经节（DRG）中P2X3受体m RNA表达变化。（3）蛋白印迹方法检测P2X3受体、ERK1/2磷酸化-ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白表达变化。（4）免疫组化法检测各组大鼠背根神经节（DRG）中P2X3受体表达变化。（5）电生理记录各组大鼠背根神经节（DRG）神经元中P2X3受体激动剂激活电流的表达变化。（6）生物信息学方法检测姜黄素与人P2X3（h P2X3）蛋白的分子对接。结果:（1）行为学结果显示:术后第7-14天,gp120组大鼠机械缩足反射阈值（MWT）和热缩足反射潜伏期（TWL）较正常组降低（p0.05）;gp120+nano curcumin组较gp120组明显升高（p<0.01）。（2）gp120组大鼠背根神经节中P2X3 m RNA表达水平均明显高于control组（p0.05）;gp120+nano curcumin组中P2X3 m RNA表达水平较gp120组明显降低（p<0.01）。（3）gp120组大鼠背根神经节中P2X3、p-ERK1/2蛋白表达水平均明显高于control组（p<0.01）;gp120+nano carrier组和gp120组无明显差异（p<0.05）;gp120+nano curcumin组中P2X3、p-ERK1/2蛋白表达水平较gp120组明显降低（p<0.01）。（4）gp120组大鼠背根神经节中P2X3免疫反应阳性表达水平均明显高于control组（p0.05）;gp120+nano curcumin组中P2X3免疫反应阳性表达水平较gp120组明显降低（p<0.01）。（5）在gp120培养的DRG神经元中P2X3激动剂α,βme-ATP（10μM）激活电流高于对照组（p<0.01）;与gp120单独处理组比较,用纳米姜黄素（0.2 g/m L）处理后,DRG神经元中P2X3激动剂α,βme-ATP（10μM）激活电流明显降低（p<0.01）;同时,与gp120单独处理组比较,P2X3拮抗剂A-317491（100 n M）处理可抑制培养的DRG神经元细胞中的P2X3激动剂α,βme-ATP激活电流（p<0.01）。（6）姜黄素在h P2X3蛋白上的分子对接是由Auto Dock 4.2产生的。h P2X3与姜黄素（-7.7,Kcal/mol）的对接评分表明,姜黄素是完全适合与h P2X3受体相互作用的。完美的匹配使姜黄素能够与ATP结合位点中的残基相互作用第二部分:二氢石蒜碱对gp120诱导卫星胶质细胞P2X4受体上调介导细胞损伤的保护作用研究目的:本研究通过HIV-gp120处理卫星胶质细胞建立细胞损伤模型。在细胞水平,研究P2X4受体是否参与HIV-gp120诱导卫星胶质细胞损伤,同时观察二氢石蒜碱对P2X4受体介导HIV-gp120相关卫星胶质细胞损伤的作用及可能机制,为HIV感染并发的神经病理痛的防治研究提供新途径。方法:实验分组:本研究通过gp120处理卫星胶质细胞（SGCs）建立细胞损伤模型。探究DRG卫星胶质细胞中P2X4受体介导HIV-gp120诱导神经损伤作用及其可能机理。细胞实验共有七个部分。第一个部分的分组为:正常组（control）,HIV-1包膜糖蛋白gp120组（200 pmol/L,400 pmol/L,800 pmol/L,1600 pmo/L）;第二个部分的分组为:正常组（control）,二氢石蒜及处理组（1μM/L,10μM/L,100μM/L,1000μM/L）;第三个部分的分组为:正常组（control）,二氢石蒜及处理组（1μM/L,20μM/L,40μM/L,80μM/L,160μM/L）;第四个部分的分组为:正常组（control）,HIV-1包膜糖蛋白gp120组（gp120）,HIV-1包膜糖蛋白gp120并二氢石蒜碱处理组;第五个部分的分组为:正常组（control）,正常组（control）并阴性对照处理（空载质粒）组（control+NC sh RNA）,正常组（control）并短发夹RNA（sh RNA）-1处理组处理组（control+P2X4 sh RNA-1）,正常组（control）并P2X4短发夹RNA（sh RNA）-2处理组（control+P2X4 sh RNA-2）,正常组（control）并短发夹RNA（sh RNA）-3处理组（control+P2X4 sh RNA-3）;第六个部分的分组为:正常组（control）,HIV-1包膜糖蛋白gp120组（gp120）,HIV-1包膜糖蛋白gp120并ATP处理组（gp120+ATP）;第七个部分的分组为:正常组（control）,HIV-1包膜糖蛋白gp120组（gp120）,HIV-1包膜糖蛋白gp120并P2X4短发夹RNA（sh RNA）处理组（gp120+P2X4 sh RNA）,HIV-1包膜糖蛋白gp120并阴性对照处理（空载质粒）组（gp120+NC sh RNA）,HIV-1包膜糖蛋白gp120并二氢石蒜碱（gp120+dihydrolycorine,DL）处理组。实验内容:（1）MTS、或TUNEL法、酶标仪法检测原代培养卫星胶质细胞（SGCs）的损伤或焦亡情况。（2）Real-time PCR方法检测卫星胶质细胞（SGCs）中P2X4、白细胞介素1β（IL-1β）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1（Caspase-1）、白细胞介素18（IL-18）、NLRP1炎症小体m RNA表达变化。（3）蛋白印迹方法检测卫星胶质细胞（SGCs）P2X4受体、p38、磷酸化-p38（P-p38）、Caspase-1、NLRP1炎症小体、炎性因子IL-1β、IL-18蛋白表达变化。（4）酶联免疫吸附测定（enzume linked immunosorbent assay,Elisa）方法检测卫星胶质细胞（SGCs）培养上清液中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素18（IL-18）的释放量。（5）应用试剂盒检测卫星胶质细胞（SGCs）培养上清液中NO的含量、三磷酸腺苷（ATP）释放量、及细胞内ROS的水平。结果:（1）gp120建模浓度筛选:MTS检测结果显示,与Control组相比,浓度为200 pmol/L的gp120处理组细胞存活率在90%以上（p<0.05）;400 pmol/L处理组细胞存活率降至80%左右（p<0.01）;800 pmol/L处理组细胞存活率降至57%左右（p<0.01）;1600 pmol/L处理组细胞存活率降至47%左右（p0.05）;1μM/L,10μM/L和100μM/L处理组细胞存活率约在95%~75%之间;而1000μM/L处理组的细胞明显大量死亡。因此,我们以400 pmol/L的gp120为模型在1μM/L~100μM/L之间设置浓度梯度来确定二氢石蒜碱的用药浓度。在1μM/L~100μM/L之间设置5个浓度梯度分别为:1μM/L、20μM/L、40μM/L、80μM/L、160μM/L。进一步分析发现,40μM/L的二氢石蒜碱开始对细胞存活产生影响,与Control比较具有统计学差异（p<0.05）;80μM/L的二氢石蒜碱具有显著性差异（p<0.01）;而160μM/L的二氢石蒜碱开始表现出细胞毒性。因此,我们选用80μM/L的浓度作为二氢石蒜碱的用药浓度。（3）MTS检测卫星胶质细胞活性:以400 pmol/L gp120为细胞损伤模型,MTS检测结果显示:与正常组比较,gp120组细胞存活率显著下降,统计学差异具有显著意义（p<0.01）,提示gp120对卫星胶质细胞有一定的损伤作用;与gp120模型组相比,gp120+二氢石蒜碱组细胞存活率有所上升（p<0.01）。提示二氢石蒜碱对gp120所致卫星胶质细胞损伤有一定的保护作用。（4）卫星胶质细胞形态变化:倒置显微镜下观察原代培养的卫星胶质细胞的细胞形态,正常卫星胶质细胞胞体呈梭形,有长突起,包膜完整具有明显的折光性,增殖状态良好。浓度为400 pmol/L gp120药物处理24 h后,细胞形态开始发生变化,细胞膨胀,胞核浓缩,轴突树突变短;用二氢石蒜碱处理后,80μM/L-二氢石蒜碱处理24 h后可使细胞状态明显改善。（5）筛选干扰效率最佳的P2X4 sh RNA序列:Real-time PCR法检测结果显示,相同时间内第1对P2X4受体sh RNA序列干扰效率最佳。（6）原代培养卫星胶质细胞的细胞外ATP（e ATP）检测结果:与Control组相比,gp120组细胞上清液中e ATP含量显著增加（p<0.01）。（7）原代培养卫星胶质细胞P2X4、NLRP1炎症小体、Caspase-1、IL-1β、IL-18 m RNA检测结果:与Control组相比,gp120组P2X4、NLRP1、Caspase-1、IL-1β、IL-18 m RNA表达水平明显增加（p<0.01）;gp120+P2X4 sh RNA及gp120+DL组中P2X4、NLRP1炎症小体、Caspase-1、IL-1β、IL-18 m RNA表达较gp120组明显降低（p0.05）。（8）原代培养卫星胶质细胞P2X4、NLRP1炎症小体、Caspase-1、IL-1β、IL-18、p38、P-p38蛋白检测结果:与Control组相比,gp120组P2X4、NLRP1、Caspase-1、IL-1β、IL-18、P-p38蛋白表达水平明显增加（p<0.01）;gp120+ATP组NLRP1、Caspase-1蛋白表达水平较gp120组显著上升（p<0.01）;gp120+P2X4sh RNA及gp120+DL组中P2X4、NLRP1、Caspase-1、IL-1β、IL-18、P-p38蛋白表达较gp120组明显降低（p0.05）。（9）原代卫星胶质细胞过氧化物和炎性因子检测结果:与Control组相比,gp120组卫星胶质细胞上清液中NO、TNF-α、IL-1β和IL-18含量增加及细胞内ROS升高,差异均有统计学意义（p<0.01）;gp120+P2X4 sh RNA及gp120+DL组细胞上清液中NO、TNF-α、IL-1β和IL-18含量及细胞内ROS与gp120组相比显著下降（p<0.01）。（10）原代培养卫星胶质细胞乳酸脱氢酶水平检测结果:与Control组相比,gp120组乳酸脱氢酶释放水平明显增加（p<0.01）;而转染P2X4 sh RNA后,gp120+P2X4 sh RNA及gp120+DL组中乳酸脱氢酶释放水平较gp120组明显降低（p0.05）。（11）原代卫星卫星胶质细胞细胞焦亡率检测结果:与Control组相比,gp120可引起原代培养卫星胶质细胞大量焦亡（p<0.01）;gp120+P2X4 sh RNA及gp120+DL组中细胞焦亡率较gp120组明显降低（p0.05）。结论:动物实验表明HIV-1病毒包膜糖蛋白gp120诱发神经病理痛大鼠DRG中P2X3受体表达增加并伴有p-ERK的表达上调以及机械性痛觉过敏和热痛觉过敏。姜黄素纳米粒可减轻P2X3受体介导的gp120相关神经病理痛行为。细胞实验表明gp120可引起大鼠背根神经节中卫星胶质细胞P2X4受体上调介导由gp120所致NLRP1-caspase-1信号激活引起的细胞损伤/焦亡。二氢石蒜碱可改善由gp120所致卫星胶质细胞P2X4受体-NLRP1-caspase-1信号激活引起的细胞损伤/焦亡。