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目的:在细胞水平研究DJ-1蛋白介导胃癌细胞多药耐药的分子机制,即探究DJ-1是否通过PTEN/PI3K/Akt/Nrf2信号通路调节NQO1、HO-1和GST等多药耐药相关效应蛋白的表达,进而参与胃癌细胞多药耐药的诱发。方法:1.利用亲本的SGC7901胃癌细胞构建DJ-1稳定过表达的SGC7901/LV-DJ-1细胞;利用多药耐药的SGC7901/VCR胃癌细胞构建DJ-1稳定低表达的SGC7901/VCR/sh DJ-1细胞。随后,Western blot检测SGC7901、SGC7901/VCR、SGC7901/VCR/sh DJ-1及SGC7901/LV-DJ-1四种不同胃癌细胞中DJ-1蛋白表达变化,同时利用CCK-8法检测上述胃癌细胞分别与长春新碱（VCR）、阿霉素（ADR）、5-氟尿嘧啶（5-FU）和顺铂（DDP）四种化疗药物共孵育24 h后的半抑制浓度(IC50)。此外,利用CCK-8法进一步检测SGC7901/VCR及SGC7901/LV-DJ-1胃癌细胞经10μM LY294002预处理或Nrf2 si RNA转染24 h后,对上述四种化疗药物的IC50值,从而观察抑制PI3K/Akt通路或Nrf2通路后对DJ-1介导胃癌细胞多药耐药的影响。2.利用SGC7901、SGC7901/VCR、SGC7901/VCR/sh DJ-1及SGC7901/LV-DJ-1四种不同胃癌细胞,通过对以下指标的检测,进一步明确DJ-1在介导胃癌细胞多药耐药过程中对Nrf2通路的影响:（1）Western blot检测Nrf2蛋白磷酸化水平的变化情况;（2）免疫共沉淀的方法检测Nrf2-Keap1的解离情况;（3）Western blot检测Nrf2在胞浆、胞核以及总蛋白中的表达变化以判断Nrf2核转位情况。3.通过Western blot检测SGC7901、SGC7901/VCR、SGC7901/VCR/sh DJ-1及SGC7901/LV-DJ-1四种胃癌细胞内p-Akt（Ser473）蛋白的表达变化,明确DJ-1在介导胃癌细胞多药耐药过程中对PI3K/Akt通路的影响;随后,通过Western blot检测SGC7901/VCR及SGC7901/LV-DJ-1胃癌细胞经10μM LY294002预处理或Nrf2 si RNA转染24 h后DJ-1、p-Akt（Ser473）、p-Nrf2及Nrf2入核的变化,进一步明确DJ-1在介导胃癌细胞多药耐药过程中,DJ-1、PI3K/Akt及Nrf2之间上下游关系。4.利用SGC7901、SGC7901/VCR、SGC7901/VCR/sh DJ-1及SGC7901/LV-DJ-1四种不同胃癌细胞,通过对以下指标的检测,观察DJ-1在介导胃癌细胞多药耐药过程中对DJ-1-PTEN相互作用、PTEN磷酸化及酶活性的影响:（1）免疫共沉淀检测DJ-1和PTEN之间的蛋白相互作用;（2）Western blot的方法检测p-PTEN蛋白的表达情况;（3）试剂盒检测PTEN磷酸酶活性。5.利用Realtime PCR和Western blot技术分别检测SGC7901、SGC7901/VCR、SGC7901/VCR/sh DJ-1及SGC7901/LV-DJ-1四种不同胃癌细胞中NQO1、HO-1、GST、MRP1和UGT的m RNA及蛋白表达水平的变化,进而明确DJ-1在介导胃癌细胞多药耐药过程中对Nrf2所调控的多药耐药相关效应子的影响;此外,利用Realtime PCR和Western blot技术进一步分别检测SGC7901/VCR及SGC7901/LV-DJ-1胃癌细胞经10μM LY294002预处理或Nrf2 si RNA转染24 h后上述多药耐药相关效应子的m RNA及蛋白的表达变化,进一步明确在DJ-1介导胃癌细胞多药耐药过程中,PI3K/Akt及Nrf2通路与NQO1、HO-1和GST多药耐药相关效应蛋白表达之间的关系。结果:1.与亲本的SGC7901胃癌细胞比较,多药耐药的SGC7901/VCR胃癌细胞中,DJ-1蛋白表达显著上调,同时对VCR、ADR、5-FU或DDP的IC50值均明显增加。然而,上述效应在DJ-1稳定沉默的SGC7901/VCR/sh DJ-1胃癌细胞中被抑制,但在DJ-1稳定过表达的SGC7901/LV-DJ-1胃癌细胞中被重现。有趣的是,SGC7901/VCR及SGC7901/LV-DJ-1胃癌细胞经LY294002或Nrf2 si RNA预处理24 h后,对上述四种化疗药物的IC50值均显著降低。2.与亲本的SGC7901胃癌细胞比较,多药耐药的SGC7901/VCR胃癌细胞中,Nrf2磷酸化增加,Nrf2与Keap1相互作用减弱,Nrf2入核明显增加。上述效应在DJ-1稳定沉默的SGC7901/VCR/sh DJ-1胃癌细胞中被抑制,而在DJ-1稳定过表达的SGC7901/LV-DJ-1胃癌细胞中被重现。3.与亲本的SGC7901胃癌细胞比较,多药耐药的SGC7901/VCR胃癌细胞中,p-Akt（Ser473）水平显著提高;同样上述效应在DJ-1稳定沉默的SGC7901/VCR/sh DJ-1胃癌细胞中被抑制,而在DJ-1稳定过表达的SGC7901/LV-DJ-1胃癌细胞中被重现。重要的是,SGC7901/VCR及SGC7901/LV-DJ-1胃癌细胞经LY294002预处理后,DJ-1表达无明显变化,但Akt（Ser473）磷酸化及Nrf2磷酸化水平均明显被抑制,Nrf2入核显著减少;然而,SGC7901/VCR及SGC7901/LV-DJ-1胃癌细胞经Nrf2 si RNA预处理后,仅抑制Nrf2磷酸化,而对DJ-1表达及Akt（Ser473）磷酸化均无明显影响。4.与亲本的SGC7901胃癌细胞比较,多药耐药的SGC7901/VCR胃癌细胞中DJ-1与PTEN蛋白相互作用显著增强,PTEN磷酸化水平增加,PTEN酶活性显著下降。上述效应同样在DJ-1稳定沉默的SGC7901/VCR/sh DJ-1胃癌细胞中被抑制,而在DJ-1稳定过表达的SGC7901/LV-DJ-1胃癌细胞中被重现。5.与亲本的SGC7901胃癌细胞比较,多药耐药的SGC7901/VCR胃癌细胞中,多药耐药相关效应因子NQO1、HO-1和GST的m RNA和蛋白表达水平均明显增加,而MRP1与UGT表达无明显变化。同样,上述效应在DJ-1稳定沉默的SGC7901/VCR/sh DJ-1胃癌细胞中被抑制,而在DJ-1稳定过表达的SGC7901/LV-DJ-1胃癌细胞中被重现。此外,重要的是,SGC7901/VCR和SGC7901/LV-DJ-1胃癌细胞经LY294002或Nrf2 si RNA转染预处理后,NQO1、HO-1和GST的m RNA和蛋白表达水平均有不同程度的下降。结论:本研究在细胞水平证实DJ-1介导胃癌细胞多药耐药的分子机制可能与其负调控PTEN,间接激活PI3K/Akt,进而激活Nrf2通路,并最终上调Nrf2所依赖的NQO1、HO-1及GST多药耐药相关效应蛋白表达有关。