埃博拉出血热(Ebola hemorrhagic fever）是一种由埃博拉病毒(Ebola virus)引起的急性病毒性传染病，是一种致死率很高的人兽共患病。主要通过患者的血液和排泄物传播，临床主要表现为急性起病，发热，肌痛，出血，皮疹和肝肾功能损害。最早于1976年在刚果（金）埃博拉河流域的苏丹南部和扎伊尔地区首次爆发，导致多人死亡。由于到目前为止，此种出血热并没有十分有效的治疗药物及疫苗，且在我国境内尚无此病症出现，因此，建立有良好特异性的检测方法显得尤为重要。所以本研究的目的主要为了制备人鼠嵌合抗体作为检测试剂盒里的阳性对照贮备，在此基础上利用鼠单克隆抗体分析埃博拉病毒核蛋白(N P)抗原表位，了解其免疫学特性，为免疫学诊断试剂的研究奠定基础。　　目前我国实验室通过实时定量荧光PCR检测埃博拉病毒核酸进行确诊，但耗时相对较长，对检测的人员和仪器要求较高。ELISA法检测血清是病原学诊断的主要指标，该种检测方法简单易操作，能够有效判断患者是否感染埃博拉以及感染程度，可用于流行病学调查，血清学指标的检测可以作为核酸检测的有力补充。基于此，本研究中研究内容主要包括以下二部分:　　一、抗埃博拉病毒核蛋白NP人鼠嵌合抗体IgG抗体表达及功能鉴定　　目前我们通过ELISA测定十株杂交瘤鼠单抗的滴度，然后选用其中滴度高的三株鼠单抗。本研究采用RT-PCR技术，从分泌抗埃博拉核蛋白单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞株中提取细胞总RNA，使用Oligo dT引物逆转录合成cDNA，利用特异性的用于扩增鼠源抗体Fab基因通用引物24对重链引物、7对Kappa轻链引物扩增出轻重链Fab片段，轻链和重链分别通过TA克隆技术克隆到Teasy载体中，经过蓝白斑筛选，挑选正确克隆，对其进行序列分析。根据序列分析的结果，设计特异性引物将鼠源抗体可变区基因VH、VL分别克隆至携带有人抗体轻重链恒定区基因的真核表达载体HL51-14，瞬时转染293T细胞，随后对其进行了免疫学检测和功能鉴定，表达并纯化获得人鼠嵌合IgG抗体。通过ELISA方法、Western-blotting、直接免疫荧光检测真核表达效果，收集293T细胞表达上清进行亲和层析纯化。利用SDS-PAGE检测纯化后抗体的纯度、ELISA方法检测纯化后的抗Ebov NP IgG全抗体的功能活性，结果显示其中1D10株，用了收集的2L转染上清纯化了1mg抗体，而1B7株纯化了0.6mg抗体，而1G9株只纯化了0.5mg抗体。ELISA方法检测纯化后的三株IgG全抗体的功能活性抗体浓度均为0.5ng。　　二、埃博拉病毒核蛋白NP抗原抗体结合表位分析　　将十株鼠单抗1B7、1D10、1G9、2D5、A5、E3、H8、C5、G1、G4进行直接竞争ELISA筛选出同竞争表位的抗体株，结果显示1D10株与H8株相互竞争，1G9株与C5株相互竞争。随后将埃博拉病毒核蛋白NP739个氨基酸进行分段表达，根据相关文献研究，先将其分为1-418AA、419-639AA、640-739AA三个片段，再将其C端100AA再分段为20AA、40AA、60AA、80AA、720-739AA五个片段，对十株鼠单抗进行抗原抗体结合表位进行研究。结果显示1B7、1D10、1G9、2D5、A5、E3、H8、C5八株鼠单抗位点均在核蛋白C端100AA中，其中1G9、1B7、1D10株位点720-739AA中，而G1、G4株则在419-639AA中。　　综上所述，通过筛选滴度高的三株鼠单抗并成功构建人鼠嵌合抗体，虽然没有抗病毒的生物活性，但是可为埃博拉出血热血清学检测做人源阳性对照储备，可用于流行病学调查，血清学指标的检测。而进一步对其埃博拉病毒核蛋白NP抗体抗原结合部分的研究，能对埃博拉病毒核蛋白功能结构域进一步认识，并为研制埃博拉病毒抗体提供了依据。