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背景:远端预处理(remote ischemic conditioning,RIC)是一个非常有效的心肌保护方法,大量的基础研究已经发现RIC能够减少心肌损伤后梗死面积,而且对很多重要的脏器(脑,肾脏,肝脏,等)有保护作用。远端预处理主要包括:远端缺血预处理(remote ischemic preconditioning,RIPC)和远端创伤预处理(remote preconditioning of trauma,RPCT)。作为一种全新的心肌保护措施,目前具体机制尚不明确,主要涉及神经和体液两个方面。虽然大量实验室研究已经明确证明其心肌保护作用,然而最近两项多中心大样本临床研究发现在选择性心脏手术患者中RIPC的心肌保护作用被取消。随后对这两项研究进行再次分析和研究发现,超过90%的心脏患者术中使用了丙泊酚,这可能是导致RIPC的保护作用被取消的一个关键因素。因此有必要研究丙泊酚在远端预处理心肌保护中的作用,进而明确RIC和麻醉药物之间的关系探索。瞬时受体电位香草酸亚型1(Transient receptor potential vanilloid type 1,TRPV1)是一种非选择性阳离子通道,最初发现在疼痛治疗中能够在伤害性刺激的感知、传递和调节中发挥重要作用。然而,最近发现TRPV1广泛存在心、肾、肺和脑等重要器官中。目前发现心肌组织和脊髓背根神经节中大量存在TRPV1,并且在缺血或缺氧下被激活后可以合成并分泌降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)和P物质共同参与维持心脏应激状态正常生理功能,如在心肌缺血损伤中发挥重要的保护作用。丙泊酚作为临床上最常用的静脉麻醉药物,能够影响TRPV1的活性。而心脏缺血再灌注损伤后,也可以引起心肌和脊髓上TRPV1表达的变化。本课题组前期已经发现心脏TRPV1是一种心脏保护的末端执行器,调节心脏TRPV1通道蛋白与钙调蛋白的相互作用能够降低再灌注损伤,在RPCT中能够明显降低心肌缺血再灌注损伤的心肌梗死面积。TRPV1参与远端预处理心肌保护作用的具体机制可能不尽相同,但是可能存在相同级联反应,即激活TRPV1通道,最后诱发心脏上感觉神经末梢释放CGRP从而对心脏有保护作用。CGRP对心脏有正性肌力和正性变时的作用,同时在一定程度上抗氧化,促进氧自由基的清除。因此,本研究假设丙泊酚可以通过影响心肌TRPV1活性,使RIC心肌保护作用消失,其机制可能是心肌中TRPV1的表达降低以及CGRP降低。本研究旨在探讨以下问题:1.心脏TRPV1在远端创伤预处理对心肌缺血再灌注损伤中的作用;2.探讨丙泊酚对心脏TRPV1介导RPCT在心肌保护的影响及机制;3.探讨不同时点给予丙泊酚对RIPC的心肌保护的影响及可能机制。方法:本研究分以下三个方面第一部分:研究心脏TRPV1在远端创伤预处理(RPCT)心肌保护中的作用。方法:采用健康雄性SD大鼠随机分为假手术组(SHAM组)、缺血再灌注组(CON组)、远端创伤预处理组(RPCT组)、TRPV1阻滞剂辣椒平(capsazepine)组(CPZ组)、辣椒平联合RPCT组(CPZ+RPCT组)共5组(n=9)。SHAM组,不做缺血再灌注损伤;CON组,建立冠状动脉前降支结扎缺血30 min,开放再灌注120 min大鼠心肌缺血损伤模型;RPCT组,下腹部行4 cm长的创伤切口预处理15min,再行缺血再灌注损伤;CPZ组,辣椒平静脉输注3 mg/kg,10 min后缺血再灌注损伤;CPZ+RPCT组,辣椒平静脉输注3 mg/kg,10 min后行腹部切口预处理15 min,再行缺血再灌注损伤。实验过程中密切记录大鼠的生命体征(收缩压、平均动脉压、心率),记录心率失常(室性早搏、室速及室颤)的发生率。再灌注120 min时处死大鼠,取心肌组织,采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法检测梗死区域并测量心肌梗死区(IS)面积和重量,左室(left ventricular,LV)重量和缺血危险区(area at risk,AAR)重量,计算IS/AAR比值和ARR/LV比值;采用免疫荧光观察大鼠心肌中TRPV1表达变化;同时采用Western blotting技术测定心肌中TRPV1的表达;采用ELISA法测定外周血肌钙蛋白的含量(cTnI)与心肌含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)活性的变化;采用TUNEL法检测心肌凋亡细胞变化。第二部分:观察丙泊酚对RPCT心肌保护的影响及可能机制。方法:采用健康雄性SD大鼠随机分为:缺血再灌注组(CON组)、远端创伤预处理组(RPCT组)、丙泊酚组(PRO组)、丙泊酚联合RPCT组(PRO+RPCT组),共4组(n=9)。CON组和RCPT组,同实验一方案;PRO组,丙泊酚12 mg/kg/h持续静脉输注10 min后,再行缺血再灌注损伤;PRO+RPCT组,丙泊酚12 mg/kg/h静脉输注10 min后,行腹部切口预处理15 min,再行缺血再灌注损伤;实验过程中密切记录各组的血流动力学和心率失常的发生率;再灌注120 min时处死大鼠取心肌组织,采用TTC法检测梗死区域并测量心肌梗死区面积和重量,左室面积重量和缺血危险区重量;采用免疫荧光双标法观察大鼠心肌中TRPV1与CGRP存在位置与分布关系;采用Western blotting测定心肌中TRPV1的表达,ELISA法测定心肌CGRP含量,血清CGRP表达变化和外周血cTnI的含量与心肌Caspase-3活性的变化,比色法检测血清乳酸脱氢酶(LDH)水平。第三部分:丙泊酚对远端缺血预处理(RIPC)心肌保护的影响。方法:采用健康雄性SD大鼠随机分为:缺血再灌注组(CON组)、远端缺血预处理组(RIPC组)、丙泊酚预处理联合RIPC组(PIPC+Ppre组)、丙泊酚后处理联合RIPC组(RIPC+Ppost组)共4组(n=9)。CON组,同第一部分;RIPC组,大鼠左下肢行3个循环5 min缺血,5 min再灌注远端预处理,后行缺血再灌注损伤模型(同第一部分);RIPC+Ppre组,丙泊酚12 mg/kg/h静脉输注10 min后,再行远端预处理。RIPC+Ppost组,左下肢远端预处理后进行缺血再灌注损伤模型建立,再灌注前5 min静脉输注丙泊酚12 mg/kg/h。实验过程中密切记录各组的血流动力学和心率失常的发生率;再灌注120 min时处死大鼠,取心肌组织,采用TTC法测定心肌梗死区重量,左室重量和缺血危险区重量;采用免疫荧光观察大鼠心肌中TRPV1表达变化;同时采用蛋白定量测定心肌中TRPV1的表达。采用ELISA法测定外周血cTnI的含量、Caspase-3活性变化。结果:第一部分:1.血流动力学指标和心律失常发生CON组在缺血30 min和再灌注120 min时点,心率(HR),平均动脉压(MAP)和心率压力乘积(RPP)均明显低于SHAM组(P<0.05),心律失常发生率明显升高(P<0.05);与CON组比较,RPCT组在缺血30 min和再灌注120 min时点,HR、MAP和RPP均明显升高(P<0.05),心律失常发生率明显降低(P<0.05),而RPCT+CPZ组和CPZ组均无明显变化(P>0.05);2.心肌梗死面积(TTC染色)和细胞凋亡率(TUNEL染色)与SHAM组比较,CON组IS/AAR比值增加,以及心肌细胞凋亡明显增加(P<0.05),同时外周血肌钙蛋白的含量与心肌Caspase-3活性明显升高(P<0.05),心肌组织;与CON组比较,RPCT组IS/AAR比值降低,同时心肌细胞凋亡明显降低(P<0.05),外周血肌钙蛋白的含量与心肌Caspase-3活性明显降低(P<0.05),CPZ组与CPZ+RPCT组与CON组比较,各组中IS/AAR比值,心肌细胞凋亡、外周血肌钙蛋白的含量、心肌Caspase-3活性和心律失常的发生率无明显改变(P>0.05);3.免疫荧光和Western blotting检测结果与CON组比较,RPCT组心肌组织中TRPV1的表达升高(P<0.05);其他各组无明显变化(P>0.05)。第二部分:1.血流动力学指标和心律失常发生率与CON组比较,PRO组和RPCT+PRO组在缺血30 min和再灌注120 min时点,HR、MAP和RPP无明显变化(P>0.05),心律失常发生率无明显变化(P>0.05);与RPCT组比较PRO组和RPCT+PRO组在缺血30 min和再灌注120 min时点,HR、MAP和RPP均明显降低,心律失常发生率明显增加(P<0.05);2.心肌梗死面积和心肌损伤指标与RPCT组比较,PRO组和PRO+RPCT组心肌IS/AAR比值明显增加,且外周血肌钙蛋白的含量与心肌Caspase-3活性明显升高(P<0.05);3.免疫双标荧光观察TRPV1和CGRP的表达,心肌组织中CGRP和TRPV1存在共表达的现象;4.CGRP的含量变化心肌组织和血清中CGRP的含量在PRO组和RPCT+PRO组比RPCT组明显升高(P<0.05)。第三部分:1.血流动力学变化及心律失常发生率与CON组比较,RIPC组和RIPC+P-post组在缺血30 min和再灌注120 min时点,HR、MAP和RPP明显升高,心律失常发生率明显降低(P<0.05),而RIPC+P-pre各个时点HR、MAP和RPP无明显变化(P>0.05);2.心肌梗死面积与心肌损伤指标与CON组比较,RIPC组和RIPC+P-post组心肌IS/AAR比值明显降低,且外周血肌钙蛋白的含量与心肌Caspase-3活性明显降低(P<0.05),而RIPC+P-pre组心肌IS/AAR比值无明显变化(P>0.05),外周血中肌钙蛋白的含量以及Caspase-3活性无明显变化(P>0.05);3.免疫荧光和Western blotting检测与CON组比较,RIPC组和RIPC+P-post组心肌组织TRPV1的表达明显升高(P<0.05),而RIPC+P-pre组的心肌组织TRPV1表达无明显变化(P>0.05)。结论:RPCT对心肌缺血再灌注损伤有保护作用,其机制可能涉及心脏TRPV1参与介导有关。静脉麻醉药丙泊酚能取消远端预处理(RPCT和RIPC)的心肌保护作用,其可能与改变心脏TRPV1活性,同时降低心肌内和血清内CGRP的含量有关。在RIPC前,开始持续泵注静脉麻醉药丙泊酚可以取消RIPC的心肌保护作用;然而,在RIPC后再灌注即刻,开始持续泵注静脉麻醉药丙泊酚并不影响RIPC的心肌保护作用。综上所述,丙泊酚对心脏TRPV1表达的影响,很可能是丙泊酚取消远端预处理心肌保护作用的关键机制。