在病原菌与寄主互作过程中,病原菌通过改变寄主植物的次生代谢产物,富集营养物质,促进自身的生长与繁殖;同时植物响应病原菌侵染,激活防卫免疫反应,调控次生代谢产物合成,产生具有抑菌活性的小分子化合物,抵御病原菌侵染。因此,植物次生代谢产物在病原菌侵染寄主植物过程中发挥着重要作用。香豆素类化合物作为一种含有苯骈α-吡喃酮母核的次生代谢产物,广泛存在于植物中,具有多种生物活性。植物通过分泌香豆素类化合物,调节根际土壤微生物组成,显著影响植物的健康;同时植物响应病原菌侵染,在根部和叶部侵染部位聚集香豆素类化合物,抑制病原菌生长。香豆素类化合物被证实在调控病原菌致病特性、植物健康等方面发挥重要作用。因此,明确特定香豆素类化合物对植物病原菌的致病特性的调控作用,有利于植物病害防控技术研发。青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种重要的土传细菌性病害,能够侵染54个科,250余种植物,包括烟草、番茄、辣椒等多种经济/蔬菜作物,造成严重的经济损失。化学防治收效甚微,容易引起环境问题;生防菌剂开发和应用面临药效慢、稳定性差等难题。目前,已有大量研究报道了香豆素类化合物在医学上作为一种抑菌剂的潜在发展前景,也有研究发现了香豆素类化合物在病原菌与寄主植物互作过程中的作用,香豆素类化合物具有安全、有效、对环境友好的特性。但关于香豆素类化合物如何影响青枯菌的生长,如何调控青枯菌致病特性的研究仍涉及较少。因此,本学位论文以香豆素类化合物与青枯雷尔氏菌为研究对象,首先评价了29种香豆素类化合物对青枯菌的抑菌活性,构建了抑菌活性的定量构效关系模型;筛选出具有代表性的羟基香豆素类化合物,伞形花内酯（7-羟基香豆素）、秦皮乙素（6,7-二羟基香豆素）、瑞香素（7,8-二羟基香豆素）,探究对青枯菌生长和侵染特性的调控作用;进一步采用转录组测序,探究青枯菌响应羟基香豆素类化合物胁迫的应激分子机制;以脂多糖合成基因lpxB为靶标,采用同源重组技术,评估了羟基香豆素类化合物对脂多糖合成和细胞膜结构的影响。进一步分析了伞形花内酯作为青枯菌III型分泌系统抑制剂的作用机理,瑞香素抑制胞外多糖的调控作用;明确了室内盆栽防控效果及田间的防控效果。本学位论文取得的主要研究结果如下:1香豆素类化合物对青枯雷尔氏菌的抑菌活性及定量构效关系模型构建采用分光光度计技术,评价了29种香豆素类化合物对青枯雷尔氏菌的抑菌活性。结果表明,共有16种香豆素类化合物对青枯菌的抑菌活性优于对照药剂（噻菌酮）,瑞香素（7,8-二羟基香豆素）对青枯菌的抑菌活性最佳,抑菌中浓度IC₅₀为16.13 mg L^-1。羟基取代基的位点和数量是决定香豆素类化合物抑菌活性的关键,在C-6、C-7和C-8位点上有羟基取代,化合物抑菌活性增强,同时具有两个羟基取代基的化合物对青枯菌的抑菌活性优于单一羟基取代基。通过皮尔森分析,构建了以Mor23u、DISPv、R3u和HATS8v为描述符的2D-定量构效关系模型,该模型的R²值达到0.861,表明模型能够解释86.1%的目标化合物。2羟基香豆素类化合物（Hycs）对青枯雷尔氏菌的生物活性及侵染特性的影响2.1 Hycs对青枯雷尔氏菌的生物活性及细胞结构的影响通过生长曲线和最小抑菌浓度测定,结果表明,羟基香豆素类化合物在50-100 mg L^-1浓度范围内能够显著抑制青枯菌的生长;瑞香素、秦皮乙素和伞形花内酯对青枯菌的最小抑菌浓度分别为64 mg L^-1、192 mg L^-1和256 mg L^-1。荧光染色结果表明,100 mg L^-1瑞香素、秦皮乙素和伞形花内酯处理青枯菌的存活率分别为7.23%、17.81%、63.61%,显著低于对照处理。透射电镜结果表明,伞形花内酯、秦皮乙素和瑞香素通过破坏青枯菌细胞膜结构,造成细胞质外泄,最终导致细菌死亡。2.2 Hycs对青枯雷尔氏菌侵染特性的影响瑞香素、秦皮乙素和伞形花内酯一定浓度范围内能够抑制青枯雷尔氏菌的生物膜形成。其中10-50 mg L^-1瑞香素和秦皮乙素对生物膜的抑制率分别达到44.98%-98.59%和13.85%-71.76%。通过平板泳动法测定了羟基香豆素类化合物对青枯菌运动性和趋化性的影响,结果表明,羟基香豆素类化合物在5-50 mg L^-1浓度范围内显著抑制青枯菌的运动性,其中瑞香素抑制效果最佳,运动直径分别为对照处理的0.76倍、0.69倍、0.65倍、0.29倍。进一步分析了羟基香豆素类化合物对青枯雷尔氏菌胞外多糖分泌的影响,结果表明,10 mg L^-1和25 mg L^-1瑞香素显著降低了青枯菌胞外多糖含量,与对照相比分别降低了1.38倍和2.63倍。RT-PCR结果显示,伞形花内酯、秦皮乙素和瑞香素能够显著抑制鞭毛运动性相关基因fliA和flhC表达量,与对照相比降低了1.57倍、2.40倍、2.35倍与1.46倍、1.60倍、1.52倍。此外,秦皮乙素和瑞香素显著降低了生物膜形成相关基因lecM表达量,相比对照表达量分别降低1.88倍和2.90倍。瑞香素特异性抑制青枯菌胞外多糖转录调控因子xpsR和epsE的表达量,与对照相比分别降低1.70倍和1.28倍。3青枯雷尔氏菌响应羟基香豆素类化合物胁迫的应激机制研究3.1青枯雷尔氏菌响应羟基香豆素类化合物胁迫的转录组分析采用原核链特异性转录组测序,分析了青枯雷尔氏菌响应羟基香豆素类化合物胁迫的转录水平变化。与对照相比,伞形花内酯、秦皮乙素和瑞香素胁迫下青枯菌显著差异表达基因分别为344个,698个和922个。其中三种羟基香豆素类化合物的共有差异基因有191个,通过基因功能注释,发现羟基香豆素类化合物显著抑制脂多糖合成基因、脂肪酸合成基因、核糖体亚基编码基因、氧化磷酸化途径基因,并诱导氧化应激相关基因和药物外排泵调控基因的转录表达。通过GO富集和KEGG pathway分析,羟基香豆素类化合物处理青枯菌的差异基因主要富集在细胞膜、质膜、核糖体、转运功能、翻译等类别;KEGG集中在次生代谢物生物合成、核糖体、ABC转运蛋白、氧化磷酸化、脂肪酸代谢等途径。进一步分析致病相关基因表达,结果表明,羟基香豆素类化合物显著抑制鞭毛相关基因、III型分泌系统相关基因的转录表达;同时瑞香素特异性抑制胞外多糖合成基因簇（Rsp1010-Rsp1020）的表达。3.2羟基香豆素类化合物调控青枯雷尔氏菌脂多糖合成的作用机理基于羟基香豆素类化合物破坏青枯菌细胞膜结构,分析与细胞膜合成有关基因表达变化。结果表明,瑞香素和秦皮乙素显著抑制青枯菌脂多糖合成基因的转录表达（Rsc0135、Rsc0136、lpxB、lpxA、fabZ、lpxD）,下调倍数分别为4.45-9.58倍和5.15-10.83倍,其中lpxB下调倍数最大,分别被秦皮乙素和瑞香素下调10.83倍和9.58倍。通过基因功能注释,lpxB是脂质A二糖合成酶,在脂多糖合成途径中发挥着重要作用,脂多糖是青枯菌细胞膜结构的重要组成成分。通过同源重组技术,构建青枯菌lpxB缺失型突变菌株,结果表明,lpxB缺失突变体的生长情况显著低于野生型青枯菌CQPS-1,同时,lpxB缺失突变体的运动性显著低于CQPS-1,与对照相比,培养36 h、48 h和60 h的运动性直径分别降低了2.67倍、3.18倍和4.97倍;生物膜显著降低2.57倍。室内盆栽表明lpxB突变体能够延缓青枯病的发生,显著降低致病力。羟基香豆素类化合物可能通过抑制脂多糖合成,破坏青枯菌细胞膜结构稳定性,导致青枯菌生长抑制,致病力降低。4伞形花内酯和瑞香素对青枯雷尔氏菌致病因子的调控作用研究4.1伞形花内酯对青枯雷尔氏菌III型分泌系统调控作用采用RT-PCR分析伞形花内酯对青枯菌III型效应系统的调控作用,结果表明,伞形花内酯能够显著降低T3SS系统上游转录因子hrpG、prhG和hrpB的相对表达量,表达量分别降低了53.12%、41.89%和62.28%,而不影响其他上游调控基因的表达,如prhA,prhR,prhI和prhJ。说明伞形花内酯主要通过hrpG-hrpB和prhG-hrpB通路抑制青枯菌III型分泌系统及效应基因的转录表达;与对照相比,RipD、RipP1、RipR、RipTAL、RipW等效应基因的表达量降低3-4倍。室内盆栽实验表明,50 mg L^-1伞形花内酯显著抑制青枯菌在烟草根部和茎基部定殖,定殖量分别是对照的0.21倍和0.06倍,显著降低了青枯菌对烟草的致病力。4.2瑞香素对青枯雷尔氏菌胞外多糖分泌功能的调控作用结合瑞香素处理青枯菌胞外多糖分泌减少,通过分析瑞香素胁迫下青枯菌转录水平变化。结果表明,瑞香素通过抑制胞外多糖合成转录调控基因xpsR的表达,降低青枯菌胞外多糖合成基因簇（Rsp1010-Rsp1020）的转录表达,其中epsB、epsC和wecC分别下调9.38、9.32、8.75倍,但不影响胞外多糖其他转录调控基因的转录表达。进一步,通过同源重组构建青枯菌基因缺失突变体,结果表明,epsB、epsC和wecC缺失突变体不影响在液体培养基中生长情况。与对照相比,三个突变体的胞外多糖分泌显著降低84.45%、91.93%和89.84%;生物膜相比于对照降低2.17倍、2.11倍和2.35倍;epsB、epsC和wecC突变体基本丧失致病力,显著延缓烟草青枯病的发生。进一步,评价epsB作为一种无致病力菌对烟草青枯病的生防作用,结果表明,epsB缺失突变菌提前施用有效延缓了烟草青枯病的发生,相对防控能达到53.25%以上。5羟基香豆素类化合物对烟草青枯病的防控效果通过室内盆栽和田间试验相结合的方式,评价了羟基香豆素类化合物对烟草青枯病的控制效果。结果表明,在不同施用方式方面,提前根部灌根施用优于接菌后灌根施用,优于叶面喷施;羟基香豆素类化合物提前灌根施用,显著降低青枯菌在烟草根部和茎基部的定殖量,与对照相比,50 mg L^-1的伞形花内酯、秦皮乙素和瑞香素的根部含菌量分别降低1.58倍、11.03倍和22.54倍,接菌后4、7、10 d的烟草茎基部含菌量分别降低4.19倍-22.27倍、5.99倍-37.04倍和11.12倍-61.67倍,有效延缓烟草青枯病的发病程度。羟基香豆素类化合物对烟草青枯病均具有一定的防控效果,其中瑞香素效果最佳,室内相对防效在38.27%-80.03%,田间的防控效果维持在40.52%⁵9.47%,与对照药剂噻菌铜的田间防控效果相当（37.98%⁶2.26%）。秦皮乙素的室内和田间的相对防效分别为24.21%⁶9.42%、36.43%⁵3.96%。综上所述,本学术论文从植物次生代谢产物-香豆素类化合物角度出发,首先分析了香豆素类化合物对青枯雷尔氏菌的抑菌生物活性,通过转录组测序分析了青枯菌响应羟基香豆素类化合物胁迫的应激分子机制,明确了羟基香豆素类化合物抑制青枯菌生长,抑制脂多糖合成基因表达,破坏细菌细胞膜结构稳定性。其次评价了羟基香豆素类化合物对青枯菌致病特性的影响,明确了伞形花内酯、秦皮乙素和瑞香素能够减少生物膜形成,降低青枯菌的早期侵染;明确了伞形花内酯通过hrpG-hrpB和prhG-hrpB控制青枯菌III型分泌系统和效应基因转录表达,从而降低青枯菌的致病力;明确了瑞香素通过控制转录调控因子xpsR,抑制胞外多糖合成基因簇表达,降低胞外多糖合成。评价了羟基香豆素类化合物对烟草青枯病的防控效果,明确了瑞香素、秦皮乙素等羟基香豆素类化合物提前灌根施用,能够有效控制烟草青枯病的发生。该研究从植物次生代谢物角度出发,阐述了羟基香豆素类化合物对青枯菌致病特性的调控作用和机理,为青枯病的绿色生态防控技术研发提供了新思路。