【摘 要】
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阪崎克罗诺杆菌可引起新生儿严重败血症、脑膜炎、坏死性小肠结肠炎等疾病,是一种重要的食源性致病菌。对其防治一般采用化学消毒制剂或高温灭菌等方式,但随着抗性菌株的出现和食品非热杀菌的需要,寻找新型替代防控方法迫在眉睫。噬菌体由于其特异性强、副作用小、成本较低、不产生耐药抗性菌株有可能成为一种新型生物灭菌剂。本文以阪崎克罗诺杆菌为指示菌,从河涌中分离并筛选得到宿主范围较宽的噬菌体,研究了噬菌体基本生物学
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阪崎克罗诺杆菌可引起新生儿严重败血症、脑膜炎、坏死性小肠结肠炎等疾病,是一种重要的食源性致病菌。对其防治一般采用化学消毒制剂或高温灭菌等方式,但随着抗性菌株的出现和食品非热杀菌的需要,寻找新型替代防控方法迫在眉睫。噬菌体由于其特异性强、副作用小、成本较低、不产生耐药抗性菌株有可能成为一种新型生物灭菌剂。本文以阪崎克罗诺杆菌为指示菌,从河涌中分离并筛选得到宿主范围较宽的噬菌体,研究了噬菌体基本生物学特性,全基因序列特征及其在乳制品中的杀菌效果。主要结果如下:1.以阪崎克罗诺杆菌(ATCC25944)为宿主菌,从广州河涌水中分离出三株裂解性噬菌体TBC-1、TBC-2及TBC-3,这三株噬菌体都表现出宿主裂解能力。噬菌体TBC-1与TBC-2边缘清晰透亮,TBC-3拥有不规则边缘且空斑模糊。经宿主谱测定,TBC-1(100%),TBC-3(77.8%)以及TBC-2(55.6%)对本实验室的阪崎克罗诺杆菌菌株(n=9)均有良好裂解能力。2.噬菌体TBC-1与TBC-3表现出不同的生物学特性。TBC-1的衣壳为二十面体,具有可收缩性尾部,最佳感染复数(Optimal Multiplicity of infection Optimal MOI,感染复数(MOI)=噬菌体滴度(PFU/ml)/宿主菌浓度(CFU/ml))为0.001,一步生长曲线显示其潜伏期20 min,爆发期50 min,爆发量100。该噬菌体在温度区间40～50℃及p H=4～10之间保持其效价稳定,对阪崎克罗诺杆菌有较好的裂解杀菌效果,MOI越高抑制效果越好。在4℃下,不同介质(脱脂冷冻干燥乳粉、甘油、LB肉汤)中7个月内保持较稳定的滴度;TBC-3为二十面体,具有不可收缩性长尾,其最佳感染复数0.1,无法测得其一步生长曲线。结合其噬菌斑及电镜形态推断,TBC-3属于温和性噬菌体。3.噬菌体TBC-1属于肌尾噬菌体科,Ounavirinae亚科,Kolesnikvirus属。TBC-1可被限制性核酸内切酶Eco R I切成8条带,推断其遗传物质为ds DNA,分子量约50kb。全基因组测序结果显示,该噬菌体基因组全长85313 bp,平均GC含量43.88%,开放阅读框(ORFs)118个,其中已知功能阅读框29个,其余为假定蛋白表达序列。已知功能模块被分为结构、包装、DNA复制与修复、核苷酸代谢、裂解及其他蛋白六大模块,无溶原基因出现。进化树显示其属于肌尾噬菌体科,Ounavirinae亚科,Kolesnikvirus属。4.噬菌体TBC-1对乳制品中阪崎克罗诺杆菌抑菌效果显著。通过对阪崎克罗诺杆菌ATCCBAA894及ATCC12868在不同MOI(10,100,1000)下杀菌效果评估,TBC-1在不同MOI下对ATCCBAA894均有抑菌效果,MOI越高抑菌效果越佳。TBC-1仅在MOI=1000下抑制ATCC12868生长。在不同MOI和温度下,对液态脱脂牛乳及乳粉中ATCC25944和ATCCBAA894杀菌实验结果表明,TBC-1在25℃下抑菌效果优于37℃;MOI=10~4时TBC-1的抑菌效果优于MOI=10~2。37℃下,MOI=10~6时TBC-1可抑制脱脂牛乳中的ATCCBAA894生长,却不能抑制脱脂乳粉中ATCCBAA894,显示食品基质影响噬菌体抑菌效力。在适当条件(37℃脱脂牛乳MOI=10~6及25℃脱脂乳粉MOI=10~4)下,TBC-1对ATCCBAA894生长抑制效果优于对指示菌ATCC25944抑制效果,显示宿主不同抑菌效果不同。论文研究结果表明:本实验分离得到的裂解噬菌体TBC-1具有显著的广谱灭菌效果,在牛乳及乳粉中能够有效抑制两种阪崎克罗诺杆菌的污染,能够应用于乳制品和其他易感食品阪崎克罗诺杆菌污染风险防控,可进一步开发成为一种针对耐药菌的新型灭菌剂。
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