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组蛋白修饰是一种重要的表观遗传学修饰方式,在基因表达调节方面发挥着重要的作用。目前已发现组蛋白具有多种修饰方式,包括乙酰化、甲基化、泛素化和磷酸化等,而组蛋白H3（Histone 3）的N端赖氨酸（lysine,K）残基的甲基化修饰最为重要。UTX（ubiquitously transcribed tetratricopeptide repeat gene on the X chromosome）作为组蛋白H3K27位点的去甲基化酶,于2007年首次报道后,至今已发现参与多种重要的生物学功能,包括多能干细胞诱导（induced pluripotent stem cells,iPS）、胚胎发育、造血过程和癌症发生发展等,但目前在代谢相关领域中的功能研究却未见报道。迄今,已见大量组蛋白甲基化修饰酶在代谢中发挥重要作用的文献报道。如,组蛋白H3K36去甲基化酶JHDM1a可负向调控肝脏糖异生过程;组蛋白修饰酶G9a可调节肝脏生物时钟节律,利于肝脏组织在Fasting和Refeeding循环中切换自如;而去甲基化酶JHDM2a则能通过抑制棕色脂肪组织与骨骼肌的脂肪酸氧化,致小鼠发生肥胖与高脂血症。类似报道很多,均提示了组蛋白修饰酶与代谢之间存在着密切的关系。针对UTX的文献复习发现,在HepG2细胞中敲低UTX基因后,肝脏糖异生关键酶PEPCK的表达量明显下调;Northern blot技术也发现UTX在成年小鼠肝脏组织中表达量较高;而模式生物线虫中,敲低或突变缺失哺乳动物同系基因UTX-1,还可明显延长线虫的寿命,而线虫寿命延长的机制则依赖于UTX对Insulin信号通路的调控,且调控作用在哺乳动物中高度保守。上述文献报道提示,UTX不但在肝脏可能具有其生物学功能,而且其功能还可能与糖脂代谢相关。据此,本研究拟探讨UTX与肝脏代谢功能之间的关系。首先以小鼠正常肝脏组织、脂肪样变性的肝脏组织为对象,分析UTX在其中的表达特征,并以胰岛素刺激小鼠原代肝脏细胞,模拟机体应答胰岛素的方式,观察UTX的表达规律,以初步采集UTX参与肝脏代谢功能的可能证据。进一步以南大模式动物研究所杨中州教授实验室现存的UTX flox小鼠为基础,通过cre同源重组酶技术,获得肝脏特异性UTX敲除小鼠,在体评估UTX在肝脏糖脂代谢中的功能,并初步探讨其可能的机制。第一部分UTX在肝脏糖脂代谢中发挥作用的证据分析目的:观察UTX在正常及脂肪样变性肝脏组织中的表达特征;应用胰岛素刺激小鼠原代肝脏细胞,分析UTX的表达规律,为深入探讨UTX在肝脏糖脂代谢中的功能研究提供更多的证据。方法:分离雌性小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、骨骼肌、胰腺、棕色脂肪与白色脂肪共10种组织,采用Western blot方法,检测UTX蛋白在各组织中的表达量;高脂诱导小鼠致肝脏组织出现脂肪样变性,分离肝脏总蛋白,应用Western blot检测UTX表达量;分离小鼠原代肝脏细胞并体外培养,用不同浓度胰岛素（0.1nM、1nM、10nM、100nM、1μM）或同一浓度100nM不同作用时间（0min、10min、30min、60min、90min、120min）分别刺激后,提取细胞总RNA,qRT-PCR分析UTX的表达规律。结果:1)在代谢相关组织中,肝脏的表达量较高,仅次于脑组织;2)UTX在脂肪变性的肝脏组织中蛋白表达量显著增加;3)UTX mRNA水平随insulin作用浓度升高而逐渐上调,至100nM时达最高;以100nM浓度insulin作用不同时间,UTX表达量在10min时即迅速上调,随后下降,并在之后的30-120min间维持较高水平。结论:UTX在正常肝脏组织与脂肪样变肝脏组织中表达均较高;在细胞水平模拟机体应答胰岛素方式,则发现UTX能够应答胰岛素刺激而表达上调,提示UTX可能参与肝脏糖脂代谢的调控。为后续进行UTX在肝脏糖脂代谢中的功能研究提供初步证据。第二部分肝脏特异性UTX敲除小鼠的构建与表型分析目的:构建UTX肝脏特异性敲除小鼠,并观察UTX肝脏特异性敲除小鼠糖脂代谢相关表型。方法:通过UTXf/f雌性小鼠与雄性albcre小鼠交配,获得实验所需的UTXf/f;albcre雌性小鼠;以qRT-PCR、Western Bolt检测其敲除效率;取UTX肝脏特异性敲除小鼠(UTXf/f;albcre),以同年龄、同性别野生型小鼠(UTXf/f)为对照,从出生后第四周开始每周称量体重;采用每日称量的方法,分析小鼠进食量与粪便排泄量;代谢笼实验实时监测小鼠呼吸商、产热、活动等能量代谢和活动能力的变化;行血液生化分析,评价甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）、游离脂肪酸（FFA）、葡萄糖（Glu）、LDL-c、HDL-c含量的差异;通过血清胰岛素水平、葡萄糖耐量实验、胰岛素耐量实验及丙酮酸耐受实验,观察UTXf/f;albcre小鼠的糖代谢;H&E染色观察肝脏组织的形态学改变;肝脏组织学分析其甘油三酯、胆固醇、糖原含量的差异;橄榄油灌胃法,观察甘油三酯清除率;腹腔注射Poloxamer-407,检测肝脏脂质分泌速率;同位素示踪法,分析肝脏脂肪酸与固醇类合成能力;采用萃取法分离并检测粪便中胆固醇、甘油三酯及胆汁酸的含量。结果:1)UTXf/f;albcre小鼠敲除效率达到70%,提示UTX肝脏特异性敲除小鼠构建成功;2)UTXf/f;albcre小鼠体重、脂肪重量、每日进食量与粪便排泄量无显著差异,代谢笼实验显示呼吸商、能量消耗、大运动及精细运动未受影响;3)血液学分析发现,UTXf/f;albcre小鼠进食后TC含量明显升高,而TG、FFA、Glu含量无显著差异;空腹状态下TC与TG水平均明显升高,并伴有LDL-C升高与HDL-C相对降低,而FFA与Glu水平未达统计学差异;4)UTXf/f;albcre小鼠糖代谢方面,胰岛素水平正常,但糖耐量与胰岛素敏感性增强,糖异生能力下降;5)肝脏组织分析发现,UTXf/f;albcre小鼠肝脏重量与病理学形态均无异常,肝脏组织中胆固醇含量正常,但甘油三酯含量与糖原含量降低;6)UTXf/f;albcre小鼠甘油三酯清除率正常;7)肝脏功能学分析发现,UTXf/f;albcre小鼠脂质分泌速率增强,肝脏固醇类与脂肪酸合成能力增强;8)小鼠粪便中甘油三酯、胆固醇、胆汁酸含量均无显著差异;9)UTXf/y;albcre雄性小鼠未发生高脂血症。结论:UTX肝脏特异性敲除小鼠构建成功。UTXf/f;albcre雌性小鼠出现明显的高甘油三酯与高胆固醇血症,血脂紊乱可能在于UTX敲除后肝脏脂肪酸与胆固醇合成能力增强,提示UTX对脂类代谢可能具有重要的调节作用。第三部分肝脏特异性UTX敲除小鼠脂代谢紊乱机制的初步探讨目的:初步探讨肝脏特异性UTX敲除小鼠脂代谢紊乱的可能分子机制。方法:采用qRT-PCR技术分析脂肪酸与胆固醇合成关键酶基因及转录因子的表达;Western blot及免疫组织化学分析UTXf/f;albcre小鼠组蛋白H3K27甲基化水平;Western blot检测其它影响H3K27甲基化状态的组蛋白修饰酶。结果:1)UTXf/f;albcre小鼠脂肪酸合成关键酶基因ACC、FAS、ELOVL5、ELOVL6、SCD1表达显著上调;但ACLY表达量无显著改变;2)胆固醇合成过程相关酶基因MVK、MVD、IDI1、SQLE、LSS表达均明显增加,但限速酶HMGCR表达无显著差异;3)脂类代谢相关转录调控因子SREBP-1c与ChREBP无显著变化,但SREBP-2表达量显著下降;4)UTXf/f;albcre小鼠肝脏组蛋白H3K27me2与H3K27me3水平均无显著变化;5)其它影响组蛋白H3K27甲基化水平的组蛋白修饰酶JMJD3、EZH2、SUZ12表达量均未见显著变化。结论:UTXf/f;albcre小鼠脂肪酸与胆固醇合成过程的关键酶,表达明显上调,可能是脂肪酸与胆固醇合成能力增强的原因。