【背景】原发性肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC，肝癌）是世界发病率第5位的常见肿瘤，是世界第3位、我国第2位的肿瘤致死原因，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势。肝癌高死亡率的原因在于肝癌的复发转移，由于其确切的机制仍不清楚，目前仍然缺乏有效的预防和治疗的手段。因此研究肝癌转移的分子机制并采取有效的预防治疗措施是提高肝癌患者疗效、改善肝癌患者预后的突破口。MircoRNAs(miRNAs)是一类长度为20-23个碱基、广泛存在于真核生物中的内源性的非编码单链小分子RNA，它们通过与靶基因mRNA的3’-端非翻译区（3’UTR）相互作用对其靶基因进行转录后水平的调节，从而参与细胞增殖、分化、凋亡、代谢等过程。异常表达的miRNAs与多种疾病，包括恶性肿瘤密切相关，在肿瘤的发生、发展过程中起到癌基因或抑癌基因的作用。近来，肿瘤侵袭转移与miRNAs的关系越来越多的受到人们的关注，miRNAs通过调节与肿瘤细胞黏附、基质降解、上皮间质转化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）、血管生成等相关的基因的表达发挥作用，许多转移相关的miRNAs分子已经被确认。其中miR-10b已被证实在不同的细胞背景或肿瘤微环境下，miR-10b发挥不同的功能，例如，在乳腺癌和食管癌中，miR-10b可以促进肿瘤侵袭转移，因此miR-10b被称作促转移因子。在恶性胶质细胞瘤中，miR-10b通过阻遏细胞周期和抑制促凋亡基因，促进癌细胞增殖并抑制其凋亡。另外，有研究证实在肝癌干细胞瘤性转化过程miR-10b表达上调，提示上调的miR-10b可能参与了肝癌的发生和发展。细胞粘附分子1（cell adhesion molecule1，CADM1）属于细胞黏附分子中免疫球蛋白超家族成员，是一种新的肿瘤抑制基因，参与细胞骨架的构建和维持细胞粘附功能的稳定，CADM1表达降低或失活与肿瘤的侵袭和不良的预后相关。既往研究表明CADM1在许多肿瘤包括肝癌中表达都是降低的。通过计算机预测和生物信息学分析，我们推测CADM1是miR-10b的潜在靶基因之一。但是，miR-10b是否参与肝癌的侵袭和转移？miR-10b在肝癌侵袭和转移中的作用是否通过调节CADM1来实现的？以miR-10b为靶点的干预是否能有效逆转肝癌细胞的转移表型？这些问题都不清楚，因此，miR-10b在肝癌发生、发展中的作用及作用机制还需进一步的研究和探索。【目的】探讨miR-10b在肝癌侵袭转移中的调节作用及其分子机制，旨在从新的角度阐明肝癌转移的机制，为寻找新的肝癌治疗靶点提供理论依据。【方法】1．收集58例（病理证实手术时发生转移36例，未转移22例）肝癌组织和10例正常肝组织标本，实时定量PCR（qRT-PCR）的方法检测miR-10b表达，分析miR-10b表达与患者临床病理特征及预后的关系。选用不同侵袭转移潜能的人肝癌细胞系HepG2、SMMC7721、MHCC97H和无转移潜能的正常肝细胞系HL-7702，qRT-PCR的方法检测miR-10b表达，分析miR-10b表达水平与肝癌细胞的迁移、侵袭能力之间的关系。2．体外观察miR-10b对肝癌细胞生物学性状的影响：将人工合成的miR-10b模拟物（miR-10b mimics）、抑制剂（inhibitors，miR-10b-AS）分别转染肝癌细胞，从而过表达和抑制肝癌细胞中miR-10b的水平，观察肝癌细胞的增殖（MTT法）、细胞周期（流式细胞仪）、凋亡（流式Annexin V染色法）、迁移（Transwell实验）、侵袭（Matrigel实验）等生物学行为的变化。3．构建miR-10b过表达慢病毒载体，将miR-10b过表达载体感染肝癌细胞以上调miR-10b表达，将这种过表达miR-10b的肝癌细胞通过尾静脉注入裸鼠体内，通过内脏转移实验在体内观察miR-10b对肝癌侵袭转移能力的影响。4．miR-10b下游靶基因的预测、验证及功能研究：利用miRanda和PicTar靶基因预测软件，综合分析相关因素，筛选出miR-10b可能的下游靶基因CADM1。利用荧光素酶报告试验验证miR-10b对CADM1的负性调控作用。在肝癌细胞中过表达或抑制miR-10b后利用qRT-PCR和免疫印迹实验（western blotting）检测靶CADM1mRNA和蛋白水平的改变。利用RNAi技术降低肝癌细胞中CADM1的蛋白表达水平，观察肝癌细胞的增殖(MTT法)、迁移(Transwell方法)和侵袭(Matrigel实验)、细胞骨架（免疫荧光染色）等生物学行为的变化。【结果】1．肝癌组织中miR-10b的表达：与正常肝组织对比，转移组与非转移组的肝癌组织中miR-10b表达水平均有一定程度的上调，然而，在转移组肝癌组织中miR-10b表达水平上调程度尤为明显(P﹤0.05)。2．miR-10b的表达水平与肝癌临床病理参数的分析结果表明：miR-10b表达与肝癌转移(P﹤0.01)、AJCC分期(p=0.016)明显相关，而与年龄、性别、乙肝、肝硬化、肿瘤大小、数目及分化无明显相关；miR-10b的高表达提示肝癌预后不良（P﹤0.01），并且是影响肝癌患者总体生存的独立风险因素（p=0.016）。3．不同细胞系miR-10b的表达及其与迁移、侵袭能力的关系：与正常肝细胞系HL-7702相比，肝癌细胞系中miR-10b表达水平均有一定程度的上调，且miR-10b表达水平与细胞的迁移、侵袭能力均显著相关（r=0.65，r=0.71）。4．在体外miR-10b对肝癌细胞的迁移和侵袭有明显的促进作用，且能影响细胞骨架的重组，但对细胞增殖、细胞周期、凋亡无明显影响。5．体内试验显示过表达miR-10b后肝癌细胞肺转移能力明显提高。6．生物信息学预测提示，CADM1可能是miR-10b的靶基因之一，荧光素酶报告实验证实miR-10b可以抑制含有其结合位点的萤光报告基因的活性，而对突变体及对照质粒没有影响。过表达或抑制miR-10b对CADM1mRNA水平无明显影响，但却对其蛋白水平有负性调节作用。用siRNA下调CADM1的表达，也能促进肝癌细胞的迁移和侵袭、影响细胞骨架的重组，与miR-10b过表达相似的效果。从而证实了miR-10b通过转录后水平负性调控CADM1参与肝癌的侵袭和转移。【结论】1．miR-10b在肝癌组织尤其是发生转移的肝癌组织及高侵袭转移潜能的肝癌细胞中明显上调，提示miR-10b在肝癌的发生和发展过程中起到促癌基因作用。2．miR-10b有望成为一种新的肝癌预后参考指标。3．过表达miR-10b能促进肝癌细胞体外和体内侵袭转移能力，反之抑制miR-10b表达则能降低侵袭转移能力，但对细胞凋亡、增殖无明显影响，提示miR-10b在肝癌转移中起重要作用。4．miR-10b通过负性调节其靶基因CADM1的蛋白表达，从而促进肝癌的侵袭和转移，二者均有成为肝癌治疗的新靶点的潜在可能性。