研究背景骨肉瘤好发于青少年和儿童,是一种常见的原发性恶性肿瘤,其发病率高、进展快,恶性程度高且容易出现远处转移,远期生存率低。统计显示,单纯行截肢手术的骨肉瘤患者5年生存率大约是16%。骨肉瘤好发于四肢长骨的干骺端,其它如髂骨、脊柱等部位也可发生。早期骨肉瘤的治疗方法以外科截肢为主,然而这种手术创伤大、致残率高,且患者远期生存率低。随着外科手术的进步和术前、术后化疗理念的引入,目前骨肉瘤的临床缓解率和远期生存率获得了很大的提高。然而,尽管外科手术及和新辅助化疗已获得了很大的发展,但临床上仍有大部分患者预后较差,我国统计的数据中,2015例患者中无病生存率占比56.0%,无复发生存率占比60.0%,复发率9.1%,肺转移率24.8%,造成这一结果的主要原因是肺转移和耐药的发生。由于目前关于骨肉瘤发生和转移的确切机制尚不明确,因此阐明骨肉瘤发生的分子机制,对于骨肉瘤的诊断和治疗具有重要意义。miRNA是近年来发现的一种小分子非编码RNA,在肿瘤的发生发展机制中起重要的调控作用。它们通过与基因的3’UTR序列互补结合导致肿瘤关键基因的转录抑制以及表达下调。研究表明,miRNAs的异常表达与骨肉瘤的增殖、转移和预后等生物学行为具有密切联系。miR-143在骨肉瘤细胞中表达异常下调,其通过调控抗凋亡蛋白BCL-2的表达,抑制骨肉瘤细胞的增殖并促进其凋亡。另外,miR-143还靶向调控基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase-13 MMP-13)的表达,调控骨肉瘤细胞的迁移和侵袭,同时还可介导瘤细胞对化疗药物的耐药性。miR-199a-3p也是介导骨肉瘤发生和发展的一个重要的miRNA分子,在骨肉瘤细胞中上调miR-199a-3p表达,导致骨肉瘤细胞增殖和迁移受到抑制。此外,miR-21在人骨肉瘤组织中呈现异常高表达,其可通过靶向调控RECK,从而实现对骨肉瘤细胞迁移和侵袭能力的促进作用。近年来的研究揭示了很多在骨肉瘤发生发展过程中发挥重要作用的miRNA,但是目前还未有一个miRNA应用于骨肉瘤治疗。因此,目前的研究重点在于揭示在骨肉瘤发生发展过程中发挥重要作用的miRNA,并阐明其调控下游靶基因的具体机制,从而为骨肉瘤的诊断和治疗提供新的分子靶标和治疗策略。整合素αV亚基(integrin subunit alpha V, ITGAV),属于整合素α链家族成员。其可通过精-甘-天冬序列(arg-gly-asp, R-G-D)与多种细胞外基质配体相结合,介导细胞与细胞外基质的信号传导。研究表明,ITGAV在调控肿瘤血管生成、肿瘤的迁移和侵袭等过程中发挥了重要作用。首先,ITGAV与胞外配体结合能促进肿瘤细胞分泌和激活金属基质蛋白蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP),通过一系列的级联反应激活血管内皮细胞并诱导其迁移；同时,ITGAV还能与bFGF和VEGF协同作用,抑制血管内皮细胞的凋亡,诱导肿瘤新生血管的生成。目前的研究还表明,ITGAV的表达水平可能对肿瘤的诊断、治疗和预后具有指示意义。研究发现,ITGAV的表达水平与结肠癌的进展密切相关,与脑胶质肿瘤的恶性程度密切相关,与喉和下咽鳞状细胞癌的分化程度和有无发生淋巴结转移相关。而且,高表达ITGAV往往提示恶性肿瘤的预后较差。现有的研究也表明,在ITGAV在人骨肉瘤组织中呈强阳性表达,且ITGAV的表达水平与骨肉瘤的恶性程度和临床分期密切相关。同时,在临床治疗中,化疗效果显著的骨肉瘤组织中ITGAV的表达水平明显下降,反之,对化疗不敏感的骨肉瘤组织中ITGAV的表达水平下降不明显,提示了ITGAV不仅可以预判骨肉瘤的恶性程度,也可作为临床中判断化疗效果的参考指标。本课题组在前期研究中通过基因芯片筛选骨肉瘤中差异表达的miRNA发现,miR-548c-3p在骨肉瘤组织和癌旁组织样本中表达具有显著差异性。有研究表明,miR-548d可以诱导细胞凋亡,引起细胞周期阻滞,从而抑制癌细胞的增殖。在乳腺癌中,niR-548-3p主要通过与ECHS1的3’UTR相结合,抑制ECHS1的表达,从而抑制乳腺癌细胞的增殖。但目前关于miR-548-3p对骨肉瘤细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭、周期和凋亡等生物学功能的影响仍不清楚。研究目的(1)阐明miR-548c-3p在骨肉瘤组织和细胞中的表达水平,研究其对骨肉瘤细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭、周期和凋亡等生物学功能的影响。(2)阐明miR-548c-3p通过调控靶基因ITGAV影响骨肉瘤细胞增殖和凋亡的分子机制。研究方法第一部分：阐明niR-548c-3p在骨肉瘤组织和细胞中的表达水平,以及它对骨肉瘤细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭、周期和凋亡等生物学功能的影响。第一步：通过荧光定量PCR技术检测miR-548c-3p在20对骨肉瘤细胞株、骨肉瘤组织和癌旁组织样本中的mRNA表达水平,然后通过统计学方法分析其中的差异性,从而初步分析miR-548c-3p在骨肉瘤组织和细胞中的表达模式；第二步：选择miR-548c-3p表达量较低的骨肉瘤细胞株SAOS2进行细胞实验,合成miR-548c-3p mimics,通过脂质体转染骨肉瘤细胞SAOS2,设三个组：Control组(只加lipofactamine)、NC组(lipofactamine+NC)和miR-548c-3p组(lipofactamine+miR-548c-3p),通过荧光定量PCR检测miR-548c-3p表达水平来验证niR-548c-3p的转染效率；第三步：通过脂质体转染法将NC和miR-548c-3p转染至骨肉瘤细胞SAOS2,设control组(只加lipofactamine),分别在转染Oh、24h、48h、72h和96h等五个时间点取细胞进行CCK8检测,比较Control组、NC组和miR-548c-3p组SAOS2细胞增殖能力；第四步：通过脂质体转染法将NC和miR-548c-3p转染至骨肉瘤细胞SAOS2,设control组(只加lipofactamine),转染48小时后提取细胞进行实验,进行平板克隆实验,比较Control组、NC组和miR-548c-3p组SAOS2细胞增殖能力,流式细胞仪检测三组SAOS2细胞的细胞周期和凋亡的检测,采用PI单染和PI/AnexinV双染法检测在骨肉瘤细胞中过表达miR-548c-3p对肿瘤细胞凋亡的影响；第五步：通过脂质体转染法将NC和miR-548c-3p转染至骨肉瘤细胞SAOS2,设control组(只加lipofactamine),转染48小时后提取细胞进行实验,分别使用不含matrixgel和含有matrixgel的transwell小室进行细胞迁移和侵袭能力检测,分析在骨肉瘤细胞中过表达miR-548c-3p对肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响；第六步：将转染后的细胞通过皮下注射的方式打入裸鼠腋下部位,细胞分组为：control组(lipofatamine组)、NC组和miR-548c-3p组。细胞注射10天后腋下部位皮下可见肿瘤性凸起,此后每隔3-4天对肿瘤的大小进行测量,记录数据绘制肿瘤的生长曲线,通过裸鼠成瘤模型分析miR-548c-3p对细胞体内增殖能力的影响。第二部分：阐明miR-548c-3p调控骨肉瘤细胞增殖和凋亡的分子机制。第一步：通过在线软件[argetscan7.0 (http://www.targetscan.org/)和miRbase (http://www.mirbase.org/)预测并筛选miR-548c-3p的靶基因ITGAV;第二步：提取癌组织和癌旁组织的RNA进行反转录,通过荧光定量PCR检测ITGAV在骨肉瘤组织和癌旁组织中的nRNA表达情况。提取癌组织和癌旁组织中的蛋白,通过WESTERN-BLOT检测ITGAV在骨肉瘤组织和癌旁组织中的蛋白表达情况；第三步：合成niRNA-548c-3p mimics、NC mimics、miRNA-548c-3p inhibitor和NC inhibitor。通过脂质体转染法将miRNA-548c-3p mimics、NC mimics、 miRNA-548c-3p inhibitor和NC inhibitor转染骨肉瘤细胞,从而实现在骨肉瘤细胞中上调或下调miRNA-548c-3p的表达。细胞分组为：miRNA-548c-3p mimics组、NC mimics组、 miRNA-548c-3p inhibitor组和NC inhibitor组；NC mimics组是miRNA-548c-3p mimics组的对照,NC inhibitor组是miRNA-548c-3p inhibitor组的对照。通过荧光定量PCR和WB检测各组细胞中ITGAV的mRNA和蛋白表达水平；第四步：通过脂质体转染法将miRNA-548c-3p mimics、 miRNA-548c-3p inhibitor、 NC分别与ITGAV 3’UTR野生型载体或突变型ITGAV 3’UTR突变型载体共转染骨肉瘤细胞,通过荧光素酶活性检测分析miRNA-548c-3p是否与ITGAV 3’UTR结合；第五步：合成ITGAV的siRNA,通过脂质体转染法转染骨肉瘤细胞,NC作为对照。通过荧光定量PCR和WB检测各组细胞中ITGAV的mRNA和蛋白表达水平,验证siRNA的转染效率；第六步：选取siRNA转染效率高的细胞进行实验,分别通过进行CCK8检测转染细胞的增殖能力,通过平板克隆实验检测转染细胞的克隆形成能力,第七步：选取siRNA转染效率高的细胞进行实验,采用流式细胞周期实验检测转染细胞的细胞周期分布情况,研究下调ITGAV表达对骨肉瘤细胞周期分布的影响；第八步：选取siRNA转染效率高的细胞进行实验,通过PI/AnexinV双染法流式细胞凋亡检测转染细胞凋亡率,研究下调ITGAV表达对骨肉瘤细胞凋亡的影响。实验结果1、miR-548c-3p在骨肉瘤组织和细胞中的表达水平,以及它对骨肉瘤细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭、周期和凋亡等生物学功能的影响。荧光实时定量PCR结果显示miR-548c-3p在癌组织中的表达显著低于在癌旁组织中的表达水平(p<0.0001)；miR-548c-3p在骨肉瘤细胞株143B(P=0.0036)、 SaoS2 (P=0.0007)、HOS (P=0.0091)中的表达水平显著低于在成骨细胞株OB3中的表达水平。CCK8检测结果显示转染48小时、72小时和96小时检测miR-548c-3p组细胞增殖能力比NC组低,P值分别为P=0.0013、P=0.0007和P=0.0001,这说明miR-548c-3p抑制骨肉瘤细胞增殖能力。平板克隆检测结果显示miR-548c-3p组细胞形成克隆数目比NC组少(P=0.0015),这说明miR-548c-3p抑制骨肉瘤细胞克隆形成能力。细胞周期结果显示,miR-548c-3p组的G2/M期细胞比例高于NC组(P<0.0001),而S期比例低于NC组(P=0.003),G1期比例与NC组无明显差异(P=0.4165)。这说明过表达miR-548c-3p导致骨肉瘤细胞周期阻滞在G2/M期。细胞凋亡检测结果显示, control组和NC组的细胞早期、晚期和总凋亡率没有显著差别(P=0.7969、P=0.6505和P=0.7552)；miR-548c-3p组的早期、晚期和总细胞凋亡率远远高于NC组(P=0.0025、P=0.0001和P=0.0006)。这说明miR-548c-3p可以促进骨肉瘤细胞凋亡。transwell检测显示,control组和NC组的细胞迁移和侵袭能力相似(P=0.8971和P>0.999)；miR-548c-3p组的迁移和侵袭能力远远低于NC组(P=0.002和P=0.0027)。这说明miR-548c-3p可以抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力。裸鼠成瘤实验结果显示,control组(lipofatamine组)和NC组裸鼠的肿瘤生长速度相似,而miR-548c-3p组裸鼠的肿瘤生长速度远远低于control组(lipofatamine组)和NC组。这说明niR-548c-3p可以抑制骨肉瘤细胞的体内增殖能力。2、miR-548c-3p通过调控靶基因ITGAV影响骨肉瘤细胞生物学功能的分子机制荧光实时定量PCR结果显示ITGAV在骨肉瘤组织中的表达水平显著高于在癌旁组织中的表达水平(P<0.0001)；miRNA-548c-3p mimics组中ITGAV的mRNA表达水平低于NC mimics组(P<0.0001)；miRNA-548c-3p inhibitor组中ITGAV的mRNA表达水平高于NC inhibitor组(P<0.0001)。WB检测结果显示,miRNA-548c-3p mimics组中ITGAV的蛋白表达水平低于NC mimics组；miRNA-548c-3p inhibitor组中ITGAV的蛋白表达水平高于NC inhibitor组。荧光素酶报告基因实验结果显示,与ITGAV 3’UTR野生型载体共转染,miRNA-548c-3p组荧光素酶活性低于NC组(P=0.0002),miRNA-548c-3p inhibitor组荧光素酶活性与NC组无明显差异(P=0.3635)；而与ITGAV 3’UTR突变型载体共转染,三组之间的荧光素酶活性无明显差异,这说明miRNA-548c-3p通过与ITGAV 3’UTR中的“GAUUUUU"序列进行特异性的互补结合。荧光定量PCR结果显示,siRNA组细胞中ITGAV的mRNA表达水平低于NC组；WB结果显示siRNA组细胞中ITGAV的蛋白表达水平低于NC组(P<0.0001)。CCK8检测结果显示siRNA组细胞增殖速度低于NC组(P<0.0001)。平板克隆检测结果显示siRNA组细胞形成的克隆数少于NC组(P=0.0016)。细胞周期结果显示,G0/G1期百分比与NC组无显著差异(P=0.7132),S期细胞的百分比低于NC组(P<0.0001),G2/M期细胞百分比高于NC组(P=0.0005)。细胞凋亡检测结果显示siRNA组细胞早期、晚期和总凋亡率均高于NC组(P<0.0001)。结论1) miR-548c-3p在骨肉瘤组织和细胞株中低表达,其表达模式符合抑癌基因的表达模式；2)在骨肉瘤细胞中过表达miR-548c-3p可抑制骨肉瘤细胞增殖和克隆形成能力,这说明miR-548c-3p参与调控骨肉瘤细胞增殖；3)在骨肉瘤细胞中过表达miR-548c-3p可抑制骨肉瘤细胞迁移和侵袭形成能力,这说明miR-548c-3p参与调控骨肉瘤细胞迁移和侵袭；4)在骨肉瘤细胞中过表达miR-548c-3p可诱导细胞凋亡,这说明miR-548c-3p可能通过诱导细胞凋亡参与调控骨肉瘤细胞增殖；5)通过生物信息学方法筛选出miRNA-548c-3p的下游靶基因ITGAV;荧光素酶报告基因实验和免疫印迹的结果显示miRNA-548c-3p通过与ITGAV 3’UTR中的“GAUUUUU"序列进行特异性的互补结合,从而下调ITGAV的表达,这可能是miRNA-548c-3p调控骨肉瘤细胞增殖能力的分子机制；6)CCK8和平板克隆实验结果显示,下调ITGAV的表达抑制骨肉瘤细胞的增殖和克隆形成能力；7)PI单染法流式细胞周期检测结果显示,下调ITGAV的表达使细胞周期阻滞与G1期,这个结果与miRNA-548c-3p对细胞周期影响一致；8) PI/AnexinV双染法流式细胞凋亡检测结果显示,下调ITGAV的表达使细胞凋亡率上升,这个结果与miRNA-548c-3p对细胞凋亡影响一致。综上所述,我们研究揭示了miR-548c-3p在骨肉瘤中的表达模式和生物学功能,同时阐明了其通过调控下游靶基因ITGAV从而影响骨肉瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的作用机制。这些机制的阐明。为深入了解骨肉瘤发生发展的分子机制提供了理论指导,同时为骨肉瘤的诊断和治疗提供了新的靶点和新的策略。