拟环纹豹蛛热激蛋白基因的克隆及表达

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热激蛋白(Heat stress protein,HSP)广泛存在于自然界的原核及真核生物细胞中,是进化中高度保守、可被多种外界胁迫因子诱导表达的一类特殊蛋白,能快速、短暂地应激抵抗不利条件对机体造成的损害。拟环纹豹蛛Pardosa pseudoannulata(B?senberg et Strand)属于节肢动物门(Arthropoda)蛛形纲(Arachnida)蜘蛛目(Araneae)狼蛛科(Lycosidae),是稻田害虫的重要捕食性天敌,经常面临温度等田间条件的变化。为认识拟环纹豹蛛暴露在高温或其它应激环境时,热激蛋白(HSP)的特性和时间表达谱模式,本文研究了其三个热激蛋白基因及热激蛋白分子特点、不同高温胁迫后不同时段的m RNA相对表达量,主要研究结果如下:1.获得了3条热激蛋白基因hsp70,hsp83,hsp90全长利用聚合酶链式反应(RT-PCR)和c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得拟环纹豹蛛3条热激蛋白基因:hsp70,hsp83,hsp90的c DNA全长序列,分别命名为Pphsp70,Pphsp83和Pphsp90,Gene Bank登录号分别为:MN820834,MN820835,MN820833。2.解析了3条热激蛋白基因Pphsp70,Pphsp83和Pphsp90生物信息学主要特点Pphsp70的c DNA全长序列为2331 bp,开放阅读框(Open Read Frame,ORF)为1917 bp,ORF推导出的多肽由638个氨基酸组成,相对分子质量为70.4 k Da,等电点(p I)为5.6;多聚腺苷酸信号(AATAAA)位于核苷酸2287-2292处;在C-末端有EEVD序列。Pphsp83的c DNA全长序列为2466 bp,ORF长度为2175 bp,ORF中推导出的多肽由724个氨基酸组成,相对分子质量为83.7 k Da,p I为4.91;多聚腺苷酸信号(AATAAA)位于核苷酸2419-2424处;在C-末端有MEEVD五肽基序。Pphsp90的c DNA全长序列为2663 bp,包括长度为2346 bp的ORF,ORF编码781个氨基酸;预测对分子质量为90.0 k Da,p I为4.88;多聚腺苷酸信号(ATTAAA)位于核苷酸2615-2620处;在C-末端有HEEL序列。氨基酸多序列比对表明,Pphsp70,Pphsp83,Pphsp90氨基酸序列与其它科蜘蛛的hsp70,hsp83,hsp90氨基酸序列有较高的相似性。系统发育树分析表明狼蛛科与球蛛科,园蛛科,隆头蛛科有较近的亲缘关系。3.揭示了不同高温胁迫下拟环纹豹蛛雌雄成蛛热激蛋白基因的时间表达谱模式通过q RT-PCR检测拟环纹豹蛛雌雄成蛛在不同温度(25、28、31、34、37、40、43℃)下胁迫12 h时Pphsp70,Pphsp83和Pphsp90 m RNA的相对表达量。雌、雄成蛛体内的Pphsp70,Pphsp83和Pphsp90均在43℃时m RNA的相对表达量最高,雌成蛛Pphsp70,Pphsp83和Pphsp90相对表达量分别是25℃(对照组)的143.4、4.5和3.6倍,呈极显著差异(P<0.01);雄成蛛Pphsp70,Pphsp83和Pphsp90的m RNA相对表达量分别是25℃的152.7、4.2及5.4倍,且与对照组呈极显著差异(P<0.01)。将雌、雄成蛛置于43℃高温,进行不同时长(4、8、12、16、20 h)胁迫,雄成蛛与雌成蛛的Pphsp70,Pphsp83和Pphsp90三条基因均在4 h时m RNA的相对表达量最高,且与对照组呈显著差异(P<0.05)。本研究表明,拟环纹豹蛛Pphsp70,Pphsp83以及Pphsp90在高温胁迫下可诱导表达,可在一定温度范围和时间范围内抵抗高温的保护作用,并暗示其短暂的快速高效表达具有生存策略意义。研究结果可为进一步了解稻田蜘蛛抵抗温度胁迫适应环境的生理生化机制和蜘蛛在生物防治中的保护利用研究提供一定的理论依据和基础信息。
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