【摘 要】
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2-吡喃酮-4,6-二羧酸（PDC）是木质素降解过程中多种代谢途径的中间产物,也是一种有价值的生物可降解塑料单体,可作为聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）中对苯二甲酸（TPA）的潜在替代物。因此,开发经济上可行的PDC生物合成方法具有重要作用。基于此,本论文的主要研究工作如下:利用已报道的原儿茶酸-4,5-双加氧酶α亚基（lig A和pmd A）酶为模板,进行氨基酸序列同源比对,构建系统发育树,筛选出
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2-吡喃酮-4,6-二羧酸（PDC）是木质素降解过程中多种代谢途径的中间产物,也是一种有价值的生物可降解塑料单体,可作为聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）中对苯二甲酸（TPA）的潜在替代物。因此,开发经济上可行的PDC生物合成方法具有重要作用。基于此,本论文的主要研究工作如下:利用已报道的原儿茶酸-4,5-双加氧酶α亚基（lig A和pmd A）酶为模板,进行氨基酸序列同源比对,构建系统发育树,筛选出16组原儿茶酸-4,5-双加氧酶（ABs）与4-羧基-2-羟基粘康酸-6-半醛脱氢酶（Cs）,构建重组质粒在大肠杆菌中表达,以原儿茶酸（PCA）为底物,在摇瓶中进行全细胞催化验证。结果显示,BL2ABC与BLlig ABC菌株得到具有良好催化性能,可在摇瓶催化6 h分别得到6.20 g/L及6.17 g/L PDC;筛选得到的BL14ABC与BL15ABC菌株具有较快的产物合成速率,摇瓶催化3h即可分别得到5.04 g/L及4.79 g/L PDC。其次,构建ABs酶与异源Cs酶组合的重组菌株,催化结果发现4-羧基-2-羟基粘康酸-6-半醛（CHMS）向PDC转化是PDC生物合成的限速步骤。由此,将BL14ABC菌株中催化限速步骤的C酶进行替换,发现BL14AB4C菌株的PDC产量可提高至5.27 g/L。构建了由两种重组大肠杆菌模块构成的多酶级联催化系统,可将生物基3-脱氢莽草酸（DHS）直接转化为PDC。其中一个模块过表达3-脱氢莽草酸脱水酶（3-dehydroshikimate dehydratase,qui C）,简称PCA模块,可转化DHS为PCA。另一个模块基于过表达上述筛选得到的ABC酶,简称PDC模块,可转化PCA为PDC。其次,对两个模块的全细胞催化条件进行了优化,对于PCA模块,BL21-qui C菌株可在最佳条件下,得到79.10 g/L PCA,摩尔转化率达100%;对于PDC模块,BLlig ABC与BL2ABC菌株可在最佳条件下,分别得到49.18 g/L及53.46 g/L PDC,摩尔转化率分别可达75%及83%。最后,将大肠杆菌WJ060通过分批补料发酵制备的DHS作为底物,利用PCA模块与PDC模块进行接力催化,在86.97 g/L生物基DHS条件下,最终得到49.19 g/L生物基PDC,摩尔转化率达63%。利用CRISPR基因编辑技术,对WJ060菌株的莽草酸合成途径进行改造,构建了PDC从头合成的细胞工厂。首先,通过将qui C基因整合到WJ060菌株基因组中,构建了PCA生产菌株PDC01。该菌株通过摇瓶发酵可得到5.40 g/L PCA,通过分批补料发酵45 h,得到38.19 g/L PCA,摩尔转化率达23.6%。由此,以PDC01作为出发菌株,通过整合2ABC基因,得到PDC09菌株,通过分批补料发酵76 h,可获得55.89 g/L PDC,摩尔转化率达29%,由此证明了该代谢路径的可行性。另外,CHMS作为PDC合成的中间产物,CHMS到PDC是整个反应的限速步骤,由此在PDC09菌株中导入了含2C基因的高拷贝质粒p BM-2C,得到的PDC092C菌株具有生长快、产量高的优点;通过分批补料发酵60 h,可得到77.57 g/L PDC,OD600可达77,摩尔转化率达29%。为进一步获得高效稳定的PDC生产菌株,增加了2C基因在PDC09基因组的拷贝数,最终得到的PDC14可通过分批补料发酵,得到105.89 g/L PDC,摩尔转化率达39%,表明所构建的工程菌株具有广阔的研究与应用前景。
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