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目的:研究白头翁汤正丁醇提取物对白念珠菌定植的溃疡性结肠炎的作用方法:本论文首先采用80%乙醇回流法提取白头翁汤中的总提取液,再用不同极性溶剂对白头翁汤乙醇总提取液进行萃取。结合本实验前期研究最终只将正丁醇提取物用旋转蒸发仪悬蒸后得到固体结晶—白头翁汤正丁醇提取物(Butyl alcohol extract of Bai Tou Weng decoction,BAEB),并通过XTT法再次验证BAEB抗白念珠菌活性;采用3.5%葡聚糖硫酸钠溶液(Dextran Sulfate Sodium,DSS)诱导小鼠急性溃疡性结肠炎模型,并通过观察判断在自由饮用七天3.5%DSS出现急性期溃疡性结肠炎症状后,用浓度为1.6×109CFU/m L的白色念珠菌(Candida albicans,C.A)标准株SC5314菌悬液每天灌胃0.5ml持续五天,以复制肠道白色念珠菌作用的溃疡性结肠炎小鼠模型;造模五天后用BAEB灌胃予以治疗,观察小鼠外形、检测小鼠结肠病理变化;并通过ELISA法检测小鼠血清上清液ASCA含量变化;采用ELISA法检测小鼠结肠黏膜组织中IL-6、IL-8、IL-1β、HBD-2、HBD-3含量变化;采用实时荧光定量q RT-PCR(real-time quantitative PCR)法检测小鼠结肠黏膜组织Toll样受体1、2、4、5、(TLR1、TLR2、TLR4、TLR5)及Dectin-1基因的表达;检测BAEB对白念珠菌定植的小鼠溃疡性结肠炎模型的治疗作用;体外实验采用培养人结肠癌上皮细胞(Caco-2细胞系)为模型,通过热灭活将白念珠菌菌体控制在酵母相(本文也称为孢子相),用BAEB预保护作用于Caco-2细胞24h后,加入热灭活的白念珠菌SC5314孢子(Candida albicans,C.A)再共培养24h,以MTT法测定Caco-2细胞存活率;以ELISA法检测Caco-2细胞上清液IL-6、IL-8、IL-1β、HBD-2、HBD-3的分泌量;采用实时荧光定量q RT-PCR(real-time quantitative PCR)法检测C.A作用Caco-2细胞后Toll样受体1、2、4、5、(TLR1、TLR2、TLR4、TLR5)及Dectin-1基因的表达;结果:1.结合前期实验室相关实验,通过XTT法检测出提取物抗菌活性检测发现白头翁汤正丁醇提取物(Butyl alcohol extract of Bai Tou Weng decoction,BAEB)最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)为64~256μg/m L,再次验证了BAEB较为有效的抗真菌作用。2.DSS定植的小鼠急性溃疡性结肠炎模型的建立(1)通过观察小鼠的一般活动情况,体重、外观变化。可见DSS模型组小鼠随着自由饮用天数的增加逐渐出现食欲减退、活动迟缓,体重减轻等症状,并伴随稀便,小鼠肛门周围也部分出现少量血液,这与文献报道溃疡性结肠炎症状相符,且加之白念珠菌感染的小鼠组别除上述状态外,体型更为消瘦,几乎无活动。(2)在造模过程中,我们通过对不同组别小鼠肠道内容物的观察,可见空白对照组小鼠粪便呈干燥颗粒状。而DSS+C.A组、DSS组,可见肠道内容物有明显的稀便,且肠道水肿严重,有明显的病理状态。同时,我们在造模过程中,观测到模型组不同组别小鼠粪便出现了明显的由稀便到便血的变化。在造模结束后,处死小鼠,观察、对比各组结肠的外观形态与长度。可见DSS与DSS+C.A组的结肠长度相较于空白对照组明显缩短,且伴随着充血、溃疡,DSS+C.A组的结肠长度最短,说明C.A的定植加重了其病理状态。(3)肠道白念珠菌定植的小鼠溃疡性结肠炎模型,冲洗并收集肠道内容物,在显色培养基鉴定显示DSS+C.A组,C.A组,BAEB治疗组均出现白色念珠菌生长,在科马嘉显色培养基呈蓝色光滑菌落;通过菌落培养计数显示DSS+C.A组比C.A组显著增多(P<0.05),治疗组经过BAEB、Mesalazine组治疗后白念珠菌菌落数显著减少(P<0.05)。(4)病理学观测:DSS模型组及DSS+C.A模型组小鼠结肠粘膜表面可见大量炎性细胞浸润,腺体萎缩,结肠粘膜表面可见高低起伏不平,有溃疡面及粘膜表面缺损。通过BAEB、Mesalazine组灌胃治疗后,上述病理现象明显减轻。(5)q RT-PCR检测了不同组别的小鼠肠粘膜组织匀浆中TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、Dectin-1的表达,与空白对照组相比,DSS模型组及白念珠菌感染的小鼠肠组织匀浆中的TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、Dectin-1的表达水平均明显升高(P<0.05),而BAEB干预后尤其是BAEB高剂量组则能显著降低TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、Dectin-1的表达水平(P<0.05)。(6)小鼠血清中ASCA(anti-Saccharomyces cerevisiae antibody,ASCA)含量测定发现DSS及DSS+C.A组均有不同程度的表达,且DSS+C.A组的表达量高于DSS组,但结果无显著性差异(P>0.05)。(7)ELISA法检测小鼠肠组织匀浆上清液中IL-6、IL-8、IL-1β、HBD-2、HBD-3含量变化,结果显示,与空白对照组相比,DSS组、DSS+C.A组IL-8、IL-6、IL-1β、HBD-2、HBD3表达量均有显著升高,与DSS+C.A组比,BAEB高剂量组干预下小鼠肠组织中的IL-8、IL-6、IL-1β、HBD-2、HBD3表达量均明显降低,表明BAEB高剂量可降低炎症表达水平。(8)采用MTT法检测,对BAEB预保护下白念珠菌热灭活孢子干预Caco-2细胞来筛选BAEB的理想干预浓度。以80μg/ml BAEB作用Caco-2细胞24h及3×106CFU/ml C.A作用Caco-2细胞24h后,Caco-2细胞生长可受到明显的抑制。(9)ELISA法检测BAEB对C.A作用下的Caco-2细胞上清液中IL-8、IL-6、IL-1β、HBD-2、HBD3表达水平,结果显示与对照组相比,模型组IL-8、IL-6、IL-1β、HBD-2、HBD3表达量均有显著升高,提示C.A作用下Caco-2细胞模型造模成功;与模型组相比,BAEB高剂量组干预下Caco-2细胞上清液中的上述表达量均明显降低,表明BAEB高剂量可降低炎症表达水平。(10)q RT-PCR法检测BAEB对C.A作用下Caco-2细胞TLRs及Dectin-1基因表达的影响。结果发现,当与热灭活的白念珠菌共培养时,Caco-2细胞TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、Dectin-1表达水平均明显上调,而BAEB干预后,BAEB高剂量组则能显著降低TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、Dectin-1的表达水平。这与体内实验部分结果相一致。结论:3.5%DSS自由饮用七天后可诱导小鼠产生急性溃疡性结肠炎,白念珠菌灌胃后可复制白念珠菌诱导的溃疡性结肠炎模型并加重溃疡性结肠炎的炎症表达,通过BAEB治疗后可有效缓解炎症因子的表达。白念珠菌热灭活孢子可刺激Caco-2细胞的炎症因子、防御素及TLRs表达上调,而BAEB预保护后则能降低其炎症因子、防御素和TLRs受体的表达。说明BAEB不仅可以直接抑制白念珠菌的生长,而且对白念珠菌引发的固有免疫过程中所涉及的肠黏膜炎症性损伤也有改善作用。