研究背景:脑血管痉挛(CVS)是蛛网膜下腔出血(SAH)后致死致残的主要原因。预防及治疗CVS一直是提高SAH患者生存质量的关键。对于CVS的发病机制及药物治疗的研究多基于各种动物模型,差异性很大,存在多种假设,尚没有一种动物模型能够完全模拟人类SAH后CVS的特点。Yu等在2011年首次报道了使用氧合血红蛋白刺激鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管痉挛模拟CVS变化的实验研究。我们在重复鸡胚CAM血管痉挛模型时发现鸡胚尿囊腔动脉(Allantoic cavity artery,ACA)所处的液体环境与人脑血管所处的蛛网膜下腔液体环境很相似,附于蛋壳内面的鸡胚CAM血管在灯光照射下清晰可见,通过针刺即可以造成尿囊腔内出血,操作方便,容易观察。基于鸡胚ACA的这种特点,我们尝试通过针刺CAM血管引起鸡胚尿囊腔内出血,观察是否可以诱导鸡胚ACA的血管痉挛,模拟SAH出血后CVS的病理变化。甘草酸苷(GL)是甘草属植物根茎提取物的有效成分,具有广泛的生物学活性,包括抗炎症反应,抗氧化应激及自由基清除等作用。有学者报道了甘草酸苷在缺血再灌注损伤中的应用,研究结果显示GL能够显著的降低小鼠大脑中动脉梗塞模型的梗死面积,改善神经功能,抑制脑水肿,并能降低脑组织中TNF-a,IL-6,COX-2,i NOS,NF-kB及GFAP的表达水平,显示GL的神经保护功能主要跟其抗炎抗氧化应激功能相关。但是GL在SAH后CVS的应用研究较少,我们在成功构建的针刺鸡胚CAM血管致尿囊腔出血诱导ACA血管痉挛模型的基础上,验证了不同剂量的GL在治疗鸡胚ACA血管痉挛模型中的作用效果,并通过蛋白电泳的方法检测了氧化应激相关指标,炎症反应相关因子,细胞凋亡相关蛋白及MAPK通路蛋白的表达变化,阐述了GL治疗鸡胚ACA血管痉挛的可能机制。研究目的:尝试建立基于鸡胚ACA的一种新的脑血管痉挛研究模型,并验证GL在ACA血管痉挛模型中的治疗作用,阐述相关机制。研究方法:(1)通过解剖11日龄鸡胚,尿囊腔注射美兰实验,病理切片及透射电镜(TEM)的方法观察鸡胚尿囊腔及ACA血管的组织结构特点,探讨了鸡胚ACA血管模拟SAH后CVS的解剖学基础。(2)180只SPF级新鲜鸡胚种蛋,随机分为正常对照(Control)组40只,假手术(Sham)组40只,实验模型(Model)组80只,各组再随机等分为1day、3day、5day、7day四个亚组,其余备用。孵化至11日龄时,Model组先使用16G注射器针头轻轻钻破蛋壳,不要伤及CAM血管,然后使用26 G注射器针头刺破CAM血管,照蛋灯下能看到明显的出血,轻轻转动鸡胚,让血液在尿囊腔内均匀弥散,尝试建立鸡胚尿囊腔出血诱导的ACA血管痉挛模型。Sham组仅用16G注射器针头钻破蛋壳,不刺破CAM血管,Control组不做任何操作。(3)分别于造模后1day,3day,5day,7day处死鸡胚,获取Control组,Sham组及Model组尿囊液及ACA血管标本,通过组织切片,免疫组化,TUNEL染色,透射电镜(TEM)检查,蛋白电泳等方法,观察ACA血管内径横截面积、管壁厚度及管壁超微结构的变化,尿囊腔内血红蛋白浓度的变化,及ACA组织内氧化应激相关蛋白,炎症反应相关蛋白,凋亡相关蛋白表达水平的变化。(4)120只SPF级新鲜鸡胚种蛋,随机分为假手术(Sham)组,实验模型(Model)组,实验模型+0.9%生理盐水(Model+NS)组,实验模型+低剂量GL(Model+3μg GL)组,实验模型+高剂量GL(Model+6μg GL)组,每组20只,其余备用。孵化至11日龄时,通过针刺CAM血管方法造模,Sham组不刺破CAM血管。造模后即刻,Model+NS组,每日给予10μl/g的0.9%生理盐水;Model+3μg GL组,每日给予10μl/g的0.3μg/μl的GL0.9%生理盐水溶液;Model+6μg GL组每日给予10μl/g的0.6μg/μl的GL0.9%生理盐水溶液,以上分剂量均分两次给药,12h一次。Sham组及Model组不给药。在造模后5day处死鸡胚,分别获取各组ACA血管标本,通过病理切片观察不同剂量的GL对鸡胚ACA血管内径横截面积及管壁厚度的影响,并通过蛋白电泳的方法检测氧化应激相关指标,炎症反应相关因子,细胞凋亡相关蛋白及MAPK通路蛋白的表达变化,阐述GL治疗鸡胚ACA血管痉挛的可能机制。结果:(1)鸡胚ACA血管所处的液体环境与人类wills环动脉血管所处的蛛网膜下腔环境相似,尿囊腔注射美兰可见ACA着色,ACA在病理学组织结构特点上与人类脑动脉血管接近。(2)尿囊腔出血模型(Model)组鸡胚的死亡率显著增加。(3)Model组在造模后3day,5day,7day时,ACA血管内径横截面积明显减小,管壁厚度明显增加。(4)TUNEL染色及TEM观察结果显示:Model组ACA血管细胞凋亡指数显著增高,内皮细胞排列疏松,失去细胞间正常的连接,细胞核核质碎裂,向核膜周边聚集,内皮下弹力层可见波浪形皱褶,管壁内可见炎性细胞的浸润。(5)Model组氧合血红蛋白及脱氧血红蛋白浓度与ACA血管内径横截面积及管壁厚度的变化趋势相一致。(6)Model组ACA组织内SOD,GR,CAT的活性及表达水平明显下降,i NOS表达水平明显增高,MDA浓度显著升高;IL-6,IL-1b及TNF-a表达水平增高;PCNA表达水平增高,a-SMA在造模后5day表达水平下降;ET-1及ETRA的表达水平升高;HIF-1a及VEGF的表达水平亦明显增高;C-Caspase3表达水平升高,而Bcl-2表达水平下调。(7)GL能够明显提高尿囊腔出血模型鸡胚的存活率。(8)GL能够缓解尿囊腔出血后ACA血管痉挛,高剂量组更加显著,但不能完全逆转。(9)GL能够缓解尿囊腔出血模型后ACA组织内SOD,GR,CAT的表达水平下降及i NOS表达水平增高;缓解IL-6,IL-1b及TNF-a表达水平增高;缓解C-Caspase3的表达水平升高及Bcl-2表达水平下调;以及缓解MAPK信号通路p-P38/P38,p-JNK/JNK蛋白表达水平比例的升高,高剂量组更加明显;GL不影响p-ERK/ERK蛋白表达水平比例的变化。结论:(1)鸡胚ACA所处的液体环境与人类wills环动脉血管所处的蛛网膜下腔环境相似,组织结构上也与人类脑动脉血管接近,是模拟SAH后CVS的解剖学基础。(2)鸡胚尿囊腔出血模型能够诱导ACA出现与人类SAH后CVS相似的病理学改变,为CVS的研究提供一种新的模型选择。(3)尿囊腔出血后血红蛋白代谢过程、氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、平滑肌细胞表型转化等参与ACA血管痉挛的发生。(4)GL能够缓解尿囊腔出血后ACA组织中的氧化应激,炎症反应及细胞凋亡水平,提高尿囊腔出血模型鸡胚的存活率,改善ACA的血管痉挛。(5)GL对尿囊腔出血后ACA血管痉挛的缓解作用依赖于对MAPK信号通路p-P38/P38,p-JNK/JNK蛋白表达的影响。