研究背景与研究目的:纳米技术在过去几十年中的快速发展,促进其在多个学科和领域中的广泛应用,可以利用纳米材料构建药物传递系统,应用于疾病诊断甚至应用于化妆品等。随着医学研究的进步和分子生物学技术的不断完善,再结合化学和物理材料学,以及基因组学、蛋白质组学等多学科技术,人们对疾病的预防、诊断和治疗的方式有了更多的认识。由于纳米具有微小性、多功能性、低成本以及高性能等特点,有利于作为药物靶向传递的开发,可解决常规诊治载体遇到的生物学屏障,免疫系统屏障等,因此成为疾病诊断与治疗中的新的高效选择。在医学领域中,包括牙科、肿瘤、免疫抗体制备等,均涉及纳米材料的引入和应用。纳米颗粒(nanoparticles,NP)与传统剂型比较,具有更多的优势,包括能够提高药物的生物利用度以及治疗的靶向性,因此纳米颗粒和纳米治疗成为众多研究小组的热点。作为能够具有较好的应用价值的纳米药物载体要将药物被运输到靶区;不仅需要本身材料粒径合适且大小均一,具备较好的生物相容性,可以包载足量药物,并且本身毒性低,对机体不会产生毒副作用,会降解,且可在体内进行循环,以确定药物能够经血液循环过程中通过毛细血管达到并蓄积于病灶组织;保证在治疗靶区内所有药物的释放过程达到有效治疗浓度,促进药物能够释放并作用于病变细胞,并介导细胞内吞,同时不对正常细胞造成损伤。壳聚糖(chitosan,CS)又称脱乙酰甲壳素,也叫甲壳胺或几丁聚糖,是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的,与多聚磷酸钠(tripolyphosphate sodium,TPP)通过离子交联方法可方便的制备壳聚糖纳米颗粒(chitosan nanoparticles,CNPs)。壳聚糖容易获得,费用低,具有良好生物相容性、可生物降解、毒性低、有效包载药物且能保护在体内不被酶破坏,因此成为了理想的高效纳米药物载体的选择。磷脂酰丝氨酸,又称复合神经酸,Phosphatidylserine,简称PS,是一类普遍存在的磷脂,磷酯化合物中的磷酸甘油酯类,通常位于细胞膜的内层,是细胞膜组分之一,与一系列的膜功能有关。磷脂酰丝氨酸(PS)具有很强的亲脂性,故在细胞周期信号的调控中起关键作用。PS可被受体CD68、CD14、膜联蛋白和β2糖蛋白Ⅰ、GAS6以及清道夫受体蛋白所识别。这些受体可以在PS包覆纳米颗粒识别中发挥了至关重要的作用,可以有效的靶向治疗。姜黄素,又名姜黄色素,英文名Curcumin,简称CU,化学结构为C21H20O6,分子量368.37,属于小分子多酚类化合物。现代医学研究认为,姜黄素具有多种药理活性,如:抗肿瘤、抗糖尿病、抗氧化、消除自由基、抗炎、降脂、抗动脉粥样硬化、抗凝、抗衰老等。姜黄素的诸多药理作用促进其在临床领域的关注度增加,尤其姜黄素的抗氧化以及降血脂、抗心血管疾病、抗肿瘤、抗糖尿病作用更得到广泛认可。有报道姜黄素可改善胰岛β细胞功能,减少胰岛素抵抗,从而预防糖尿病进展。但姜黄素的生物利用度很低,而且受环境因素的影响。当姜黄素在碱性环境中发生降解,导致其药理作用降低,影响其临床应用。由于纳米载体的本身粒径非常小,利用体内循环,并延长作用时间,提高靶向部位药物浓度,并可一定程度上增加药物的水溶性和稳定性,因此将姜黄素和纳米技术联合应用成为新的目标,为姜黄素输送体系达到好的效果提供可能,以便于姜黄素在临床上能够得到更有效得应用。但也存在一定的问题,包括应用纳米载体给药或者给药剂量过高,高浓度的姜黄素会导致体内活性氧(ROS)增加,引起氧化应激,也是导致肿瘤发生的因素之一。姜黄素和部分纳米载体结合可导致细胞的DNA损伤,减少抑癌基因p53的活性。因此采用合适的纳米载体技术制备姜黄素纳米颗粒,可提高抗氧化,抗心血管疾病以及抗肿瘤的临床疗效,具有良好的应用前景。糖尿病患者最严重的的并发症之一是糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)。近年来我国DN的发病率逐年上升,目前仅次于各种肾小球肾炎,已然成为终末期肾脏病(end-stagerenaldisease,ESRD)的第二位原因。由于DN复杂的致病机制和代谢紊乱,一旦患者进入到ESRD,其治疗通常比其他肾脏疾病更加困难和棘手。因此在延缓糖尿病肾病进展中,早期防治具有重大意义。糖尿病肾病的发病机制尚不完全清楚。细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在系膜区堆积是DN的主要病理特征,肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cells,GMCs)是糖尿病肾病的靶细胞。发生糖尿病并发症共同的病理生理基础,目前认为是糖尿病患者高血糖所诱导的氧化应激(oxidative stress,OS)。高糖进入肾小球系膜细胞后可引起系膜细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生增加,其机制是通过线粒体(mitochondria)途径和激活NADPH氧化酶。故ROS是高糖的信号分子(signaling molecules),经MAPK及JAK信号通路(signalingpathway),GMCs细胞内的一系列转录因子,如核因子κB(NF-κB)、活性蛋白1(AP-1)被激活,继而引起单核趋化蛋白-1(MCP-1)、转化生长因子-β1(TGF-βl)、PAI-1等细胞因子(cytokines)的表达上调,最终介导肾组织纤维化的发生。所以,如果能抑制系膜细胞内由高糖诱导的ROS聚集将会有可能阻断高糖所带来的一系列病理效应,其意义重大。在本研究中我们成功制备了姜黄素壳聚糖纳米颗粒(CNPs-CU)、磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素壳聚糖纳米颗粒(PS-CNPs-CU),分析PS-CNPs-CU、CNPs-CU的特征和性能。评估PS-CNPs-CU、CNPs-CU和游离的姜黄素(CU)应用对人胚肾细胞(HEK-293)的细胞毒性作用;进一步深入研究PS-CNPs-CU及CNPs-CU的遗传毒性作用。并通过建立高糖环境下培养的大鼠肾小球系膜细胞(GMCs),分析CU、CNPs-CU和PS-CNPs-CU对GMCs增殖的抑制作用以及相关机制的初步探讨。研究方法:壳聚糖的游离氨基可与多聚磷酸钠(TPP)的阴离子发生离子交联反应,从而制备规格一致的空白壳聚糖纳米颗粒(blank CNPs)和姜黄素壳聚糖纳米颗粒(CNPs-CU)。磷脂膜与分散的CNPs和CNPs-CU的水化而制备PS-CNPs和PS-CNPs-CU。CNPs-CU、PS-CNPs-CU、CNPs 和 PS-CNPs 的纳米颗粒直径、多分散指数(PDI)采用Malvern Zetasizer 2000检测;Zeta电位采用Malvern Zetasizer激光多普勒测定。所有的纳米颗粒用三蒸水(TDW)稀释到适当的浓度,仪器在全自动模式进行测量。包封率(%EE)是计算包载在CNPs-CU、PS-CNPs-CU中的姜黄素(CU)药物的含量。利用高分辨透射电镜观察PS-CNPs-CU纳米颗粒的形态学。利用高效液相色谱(HPLC)仪测定CNPs-CU、PS-CNPs-CU中的姜黄素(CU)的累积释放率。通过所制备的PS-CNPs-CU、CNPs-CU和游离的姜黄素(CU)进行体外细胞毒性研究。利用MTT法(量热法)进行评估纳米颗粒和游离的姜黄素对人胚肾细胞系(HEK-293)细胞活性的影响。分析测量多倍体和染色体畸形的情况来评价PS-CNPs-CU、CNPs-CU的遗传毒性。实验步骤依据相关报道进行。将动物分为随机四组,分别为阳性对照(环磷酰胺组,40 mg/kg给药);CNPs-CU组(相当于100 mg/kg姜黄素剂量);PS-CNPs-CU组(相当于100 mg/kg姜黄素剂量);阴性对照组(给予赋形剂和蒸馏水)。用小鼠骨髓嗜多染红细胞(polychromatic erythrocytes,PCE)微核试验,评估遗传毒性(分析至少1000个PCE)。观察100个平铺良好的中期细胞的染色体畸变(CA),将CA检测作为遗传毒性的标记物。将大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)细胞随机分为6组:分别为高糖对照组,在细胞培养液中加入含30 mmol/L葡萄糖,建立高糖环境培养下的大鼠肾小球系膜细胞模型;以及姜黄素组(CU)、CNPs组、PS-CNPs组、CNPs-CU组和PS-CNPs-CU组,其他各组在建立高糖培养条件下,同时加入各作用药物,姜黄素浓度相当于10μg/ml,作用24h。分析各组细胞ROS含量变化。检测各组细胞中谷胱甘肽(GSH)和总超氧化物歧化酶(SOD)活性变化;Western Blot检测在各组细胞中NF-κB蛋白变化。Real time PCR法检测各组细胞中NF-κB和TNF-α和IL-1β和TGF-β1的mRNA表达变化。ELISA检测各组细胞上清液中NF-κB和TNF-α和IL-1β和TGF-β1的表达。利用MTT法检测各组系膜细胞的增殖情况。结果:1.CNPs 和 CNPs-CU 的纳米颗粒直径分别是 99.6 ± 2.15 nm 和 167.6±3.53 nm。二者的粒度分布较窄,多分散指数(polydispersityindex,PDI)都较低(<0.2),分别是0.072±0.02和0.115±0.014。二者的zeta电位是正电位,分别是19.9±1.27 mV 和 21.9±1.31 mV。2.PS-CNPs和PS-CNPs-CU的纳米颗粒直径分别是176.7 ± 2.21 nm和220.5±3.67 nm。二者的的粒度分布也较窄,PDI分别是0.124±0.016和0.148±0.019。二者的zeta电位则是负电位,分别是-19.9±1.33 mV和-25.4±2.13 mV。3.CNPs-CU 包封率是(%EE)59.4±3.1%,而 PS-CNPs-CU 包封率(%EE)是50.4±3.7%。PS-CNPs-CU包封率低于CNPs-CU,但差异不具有统计学意义4.高分辨透射电镜观察分析:PS-CNPs-CU的形态学特征完全符合,纳米颗粒呈球形,形态较规则,脂质层作为连续的层面覆盖CNPs。5.pH 7.4时,37℃条件下,2h后,CNPs-CU中姜黄素的释放率是31.82%,而PS-CNPs-CU是22.64%。接下来的12h,CNPs-CU中姜黄素的释放率81.82%,而PS-CNPs-CU姜黄素的释放率73.77%。24h,CNPs-CU中姜黄素的释放率94.17%,而PS-CNPs-CU姜黄素的释放率83.94%。均显示非常好的控制释放特性。6.无论是壳聚糖纳米颗粒(CNPs)还是PS修饰的壳聚糖纳米颗粒(PS-CNPs)在各浓度中对细胞毒性不超过5%。在逐步递增的浓度(1μg/ml,5μg/ml和10μg/ml)中PS-CNPs-CU的细胞毒性高于CNPs-CU,但差异不具有显著性。7.当用环磷酰胺处理动物,可观察到微核细胞显著增多,与用非致畸处理对照组、CNPs-CU组和PS-CNPs-CU组比较,差异具有统计学意义(P<0.001)。8.与对照组比较,CNPs-CU和PS-CNPs-CU的注射并未导致染色体畸变。然而,当用环磷酰胺处理动物,可导致大量染色体畸变,用非致畸处理对照组、CNPs-CU组和PS-CNPs-CU组比较,差异具有统计学意义(P<0.001)。9.各姜黄素作用组可明显减少高糖条件下GMCs的ROS产生,与高糖对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。并且,PS-CNPs-CU组和CNPs-CU组进一步减少ROS的产生,与姜黄素组(CU)比较,差异具有统计学意义(PP<0.05),其中PS-CNPs-CU组减少更加显著(P<0.01)。i0.各姜黄素作用组可增加高糖条件下GMCs的GSH和SOD活性,与高糖对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。并且,PS-CNPs-CU组和CNPs-CU组进一步增加GSH和SOD活性,与CU组比较,差异具有统计学意义(PP<0.05),其中PS-CNPs-CU组增加更加显著(P<0.01)。11.各姜黄素作用组可抑制高糖条件下GMCs的NF-κB mRNA及蛋白的表达,与高糖对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。并且,PS-CNPs-CU组和CNPs-CU组可进一步抑制NF-κB mRNA和蛋白的表达,与CU组比较,差异具有统计学意义(P<0.05),其中PS-CNPs-CU组抑制更加显著(P<0.01)。12.各姜黄素作用组可抑制高糖条件下GMCs的TNF-α mRNA、IL-1β mRNA、TGF-β1mRNA的表达,与高糖对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。并且,PS-CNPs-CU 组和 CNPs-CU 组进一步抑制 TNF-α mRNA、IL-1β mRNA、TGF-β1mRNA的表达,与CU组比较,差异具有统计学意义(P<0.05),其中PS-CNPs-CU组抑制更加显著(P<0.01)。13.各姜黄素作用组可抑制高糖条件下GMCs上清液中TNF-α、IL-1β、TGF-β1分泌,与高糖对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。并且,PS-CNPs-CU组和CNPs-CU组可进一步抑制TNF-α、IL-1β、TGF-β1分泌,与CU组比较,差异具有统计学意义(P<0.05),其中PS-CNPs-CU组抑制更加显著(P<0.01)。14.各姜黄素作用组可抑制高糖条件下GMCs的细胞增殖,与高糖对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。并且,PS-CNPs-CU组和CNPs-CU组进一步抑制GMCs的细胞增殖,与CU组比较,差异具有统计学意义(P<0.05),其中PS-CNPs-CU组抑制更加明显(P<0.01)。结论:1.通过水溶性壳聚糖,利用离子交联方法,并利用磷脂酰丝氨酸修饰,成功制备了姜黄素壳聚糖纳米颗粒(CNPs-CU)和PS修饰姜黄素壳聚糖纳米颗粒(PS-CNPs-CU)。2.PS-CNPs-CU、CNPs-CU具有良好的缓控释特性,进而为疾病治疗研发新型纳米颗粒提供新的方案和参考依据。3.PS-CNPs-CU、CNPs-CU的细胞毒性和遗传毒性低,作为药物载体安全可靠。4.姜黄素可通过调控氧化应激反应,抑制炎性因子,进而抑制高糖环境下GMCs的细胞增殖,可参与调控糖尿病肾病的发生、发展。5.PS-CNPs-CU可明显提高姜黄素的作用,增强对GMCs细胞增殖的抑制作用,有望成为一种理想的糖尿病肾病治疗的靶向药物载体。