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硒代半胱氨酸(Selenocysteine,Sec,U)是第21种天然氨基酸,由终止密码子UGA编码,通过复杂机制掺入多肽链中形成硒蛋白(Selenoprotein)。硒蛋白广泛存在于生物体中,可以调节机体氧化应激、影响细胞凋亡、维持细胞生长与增殖等。在原核生物中,Sec的合成需要tRNASec与硒代半胱氨酸合成酶(Sec synthase,SelA)、硒代半胱氨酸特异性延伸因子(Sec-elongation factor,SelB)相互作用。首先,丝氨酰-tRNA合成酶(Seryl-tRNA synthetase,SerRS)催化 tRNASec 生成 Ser-tRNASec;然后,由 SelA 蛋白催化 Ser-tRNASec形成Sec-tRNASec;随后,SelB识别并结合Sec-tRNASec和硒代半胱氨酸插入序列(Selenocysteine insertion sequence,SECIS),最后,完成掺硒过程。目前硒蛋白掺硒效率较低、硒蛋白产量低是硒蛋白研究面临的主要问题,原核体系的掺硒机制函待解决。在本研究中,我们基于原核体系大肠杆菌掺硒机器,从大肠杆菌tRNASec与SelA和SelB相互作用的核苷酸位点入手,寻找tRNASec骨架上关键核苷酸位点。具体开展了以下工作:1)首先利用定点突变方法构建新型tRNASec突变体;2)然后利用BL21(DE3)gor-(pET-TRSter/p SUABC)菌株表达哺乳动物细胞质型硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase 1,TrxR1),利用 2’5’ ADP-Sepharose 亲和层析纯化TrxR1这种硒蛋白;3)再利用经典DTNB反应测定TrxR1的酶活,评价掺硒效率,完成定向进化;4)最后,表达纯化SelA蛋白,实施EMSA实验检测SelA与tRNASec突变体的结合紧密程度。结果显示:当SECIS元件与SelA、SelB、tRNASec共表达时,与野生型相比,绝大多数突变型TrxR1酶活以不同程度的降低。其中,E.coli tRNASec的G18、G19这两个位点的所有突变体TrxR1的酶活远低于野生型的(<10%)。其中,U20C突变体的比活力比野生型高10%。而在缺少selA、selB、selC的情况下表达TrxR1,大多数突变体的掺硒效率降低,少数突变体的掺硒效率提高。结论:E.coli tRNASec骨架上的一些关键核苷酸位点维持了其稳定性和灵活性,影响掺硒机制。G18、G19可能是维持E.coli tRNASec三级结构的关键核苷酸位点,C15、C16、U20、A21 是与 SelA 结合的位点,C50、A51、C56、C59、U63、G64、U65 可能是与SelB结合的位点。不同tRNASec突变体可以结合不同数量的SelA和SelB,这可能是因为突变体的结构变化影响与SelA和SelB的结合程度。意义:本研究首次提出E.coli tRNASec上调控掺硒机制的关键核苷酸位点,初步揭示了原核掺硒元件tRNASec与SelA、SelB反式作用因子之间的相互识别与调控机制,为细菌工程化改造tRNASec来制备全长硒蛋白提供了新见解。