研究背景电离辐射、化疗药物及细胞代谢产物在内的多种外源和内源性因素都能引起不同形式的DNA损伤,其中DNA双链断裂(DNA double-strand break, DSB)为最严重的损伤形式。DNA损伤后,细胞会启动相应的修复通路对其进行修复。在高等真核生物中,DSB主要激活同源重组修复(Homologous recombination repair, HR)和非同源末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)两条修复通路[1,2]。如果修复过程中一些重要蛋白分子功能的缺失或是外源性因素导致修复过程受阻,使DNA损伤得不到修复或不完全修复,导致基因组的不稳定,最终引起细胞的突变、癌变甚至是死亡。所以修复通路的研究对肿瘤的发生及治疗有着重要的意义。同源重组修复是以同源片段为模板通过姐妹染色体交换和重组完成损伤DNA的修复,是一种非常精确的修复方式。HR修复通常在细胞周期中的S期、G2期及M期进行。而由于同源重组修复的半修复时间需要数小时,故具有修复效率慢的特点。同源重组修复大体可分为以下几个步骤：(1)DNA损伤位点的识别；(2)DNA损伤位点的加工处理；(3)链侵入和修复性合成；(4) Holliday联结的形成与解离。具体简述如下：细胞在受到电离辐射照射并产生DSBs后,ATM迅速检测到损伤并结合至DNA断裂部位,使H2AX磷酸化,后者促进NBS1和DNA结合,NBS1和MRE11、RAD50形成MRE11/RAD50/NBS1(MRN)三元复合物。细胞中的核酸外切酶,如MRE11/RAD50/NBS1(MRN)三元复合物中的MRE11对DNA断裂末端进行5’→3’方向的切割加工,暴露出3’单链DNA末端,后者与若干个复制蛋白A(replication proteinA, RPA)分子结合,起到稳定并保护DNA单链、防止形成二级结构的作用[4]。RAD51竞争性置换3’单链DNA末端上结合RPA分子,并覆盖在暴露的DNA单链上,形成“核蛋白丝’’(nucleoprotein filament)。RAD51引导核蛋白丝识别同源DNA模板并催化DNA链的配对、延伸、形成Holliday联结(Holliday junction),完成链交换过程。Holliday联结经核酸酶和连接酶切割和再连接后解体,得到两个完整的双链DNA分子[5]HR修复过程中有许多基因和蛋白参与调控,如：ATM基因、BRCA1和BRCA2基因、RAD51蛋白、XRCC2和XRCC3蛋白分子等等。而ATM基因在修复过程中起着尤为重要的作用。ATM基因最早发现于共济失调性毛细血管扩张综合征(ataxia telangiectasia, AT)患者,ATM的突变是直接的发病原因。ATM缺失细胞株具有染色体不稳定、对电离辐射敏感、细胞周期阻滞缺陷等特征。ATM基因在细胞信号传导通路中主要参与：1)激活细胞周期检测点。DNA损伤后可以通过激活细胞周期检测点,延缓细胞周期进程,从而在S期DNA复制或染色体有丝分裂前修复受损的DNA。细胞周期检测点可在G1/S期、S期和G2/M期被激活。ATM可以磷酸化,包括p53、c-Abl和复制蛋白A(replication proteinA, RPA)等底物激活辐射所致DNA损伤的信号传导通路。p53的15位丝氨酸被ATM磷酸化致其活化而激活G1/S期检测点[6]；ATM磷酸化Nibrin而活化Nbs1/Nibrin与Mer11/Rad50形成的复合物,激活S期检测点,G2/M检测点的活化则主要与Chk2其N末端68位苏氨酸的磷酸化有关[6]。2)调控DNA损伤的修复。DNA的损伤可以激活ATM,通过以下几种方式修复DNA：ATM可使BRCA1的多个位点磷酸化；ATM其后的靶Chk2也可在BRCA1与其分离后,磷酸化其988位的丝氨酸而激活BRCA1；通过使与BRCA1结合并抑制其功能的CtBP作用蛋白(CtBP-interacting protein, CtIP)的磷酸化,使其从BRCA1释放并使后者活化；ATM经其后方的靶c-Abl调整RAD51的活性。ATM通过激活与DNA修复相关的BRCA1和RAD51调控DNA损伤的修复。3)调控细胞凋亡。A-T中幼稚的细胞有凋亡损伤,对有ATM(ATM在小鼠的同源蛋白)缺陷小鼠的研究证实ATM在放射线辐射引起的细胞死亡中可促进凋亡,且在发育中的中枢神经系统表现的特别明显。敲除ATM的小鼠模型与p53缺陷的小鼠相似,表现对放射线辐射引起凋亡的抵抗,证实在发育中的中枢神经系统,通过ATM和p53的信号传导是细胞死亡的重要决定因素[7]。肿瘤的治疗的目的是尽可能多的杀灭肿瘤细胞并且尽可能少的影响到正常组织细胞。针对肿瘤细胞有无限增殖能力,也出现了直接阻滞细胞周期,抑制肿瘤细胞增殖的药物,但这类药物都对正常组织有着较大的损伤,临床应用上受到一定限制。所以,开始有大量研究针对DNA损伤修复途径,间接抑制肿瘤细胞增殖的方法。而同源重组(HR)修复在DNA损伤修复中占重要地位,所以抑制肿瘤细胞HR修复或利用HR修复缺陷有可能成为肿瘤治疗的又一重要方法。在肿瘤放射治疗方面,调节ATM基因表达与放射敏感性的研究也逐渐增多。ATM基因在HR修复细胞信号传导通路中主要参与：激活细胞周期检测点、调控DNA损伤的修复及调控细胞凋亡。在放射线照射后,DNA的损伤修复过程中依赖于检测点途径的调控,这些检测点在细胞的潜在致死性损伤的修复中起着决定性作用[14],从而可能产生一系列特异性的放射敏感性靶点,ATM蛋白激酶是这些检测点的重要组成部分,是控制DNA复制的信号传导系统的重要组成部分,通过对ATM蛋白激酶磷酸化调节,来调控DNA修复蛋白完成细胞对损伤的反应。在细胞受到放射线照射后,可引起ATM激酶的活性改变,从而导致多种下游蛋白的磷酸化。从而降低DNA修复的程度,提示DNA修复缺陷是ATM细胞放射敏感性增加的原因[15]。如果有选择地加重肿瘤细胞的DNA损伤,抑制其修复,可以增强其放疗的效果,即达到放疗增敏的目的。所以能抑制ATM基因功能,调控DNA损伤修复及细胞周期变化,即可达到有效的辐射增敏作用。ATM蛋白激酶的活性改变引起DNA修复进程的中断是导致放射高敏感性的重要原因。ATM激酶阻滞剂能有效的提高肿瘤细胞的放射敏感性,一些小分子抑制剂可抑制ATM中的放射敏感性相关酶的活性,导致细胞循环检测点缺失,从而提高肿瘤细胞的放射敏感性。研究目的：1、构建沉默ATM基因的HepG2肝癌细胞模型(Anti-ATM HepG2),并检测对ATM基因的干扰效果。2、按不同照射剂量、时间及细胞分组,通过γH2AX检测技术,比较沉默ATM基因前后在各时间点和剂量点DSB损伤及其修复的水平。研究方法：1、干扰载体的构建根据靶基因设计并合成4对miRNA oligo序列。这4对oligo经退火、重组克隆、插入miRNA表达载体后,构建4个miRNA质粒,并转化入感受态细胞DH5α。再分别挑取克隆,用载体通用引物进行菌落PCR筛选。筛选得到的阳性克隆进行测序,以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的oligo序列一致。验证无误后扩增质粒备用。2、检测干扰载体在HepG2细胞中的干扰效果将4个干扰载体分别瞬时转染入HepG2细胞,通过qPCR检测细胞样品中目的基因和内参基因的表达量,使用转染阴性干扰载体的样品作为对照样品,比较各瞬时转染干扰载体组样品目的基因的表达,并计算干扰效果。3、通过γH2AX检测技术,比较沉默ATM基因前后在各时间点和剂量点DSB损伤及其修复的水平。按实验要求根据照射剂量、检测时间及沉默ATM基因前后hepG2细胞类型,3个因素进行分组,对各组细胞进行X线照射处理,按预定检测时间,通过γH2AX检测技术对各组细胞进行处理,比较沉默ATM基因前后在剂量水平和修复时间水平的焦点数,分析DSB损伤及修复。4、统计学处理实验数据以x±s表示,采用SPSS13.0进行统计分析(检验标准：α=0.05)。qPCR法检测不同干扰载体瞬转入细胞后ATM基因的表达情况,采用单因素方差分析(one-way ANOVA),多重比较采用LSD法。方差不齐时,采用Dunneett’s T3法。γH2AX分析DNA损伤(免疫荧光法)采用析因设计的方差分析。结果1、干扰载体的构建针对靶基因ATM基因构建的四个干扰质粒分别为：pcDNA6.2TM-GW/mir7-ATM-1, pcDNATM6.2-GW/mir7-ATM-2, pcDNATM6.2-GW/mir7-ATM-3, pcDNATM6.2-GW/mir7-ATM-4。经过比对,重组克隆中插入片段序列与设计的oligo序列完全一致,因此miRNA干扰载体的构建成功。2、检测干扰载体在HepG2细胞中的干扰效果将转染后48小时的5个细胞样品提取小分子RNA。后者经逆转录生成cDNA,qPCR检测,扩增曲线显示所有样品均已进入扩增平台期。qPCR检测细胞样品中目的基因和内参基因的表达量,根据qPCR反应曲线得到各样品目的基因和内参基因的Ct值,采用△△Ct的方法进行相对定量。使用转染阴性干扰载体的样品作为对照样品,比较各瞬时转染干扰载体组样品ATM基因的表达2-△△ct情况,采用多个独立样本方差分析。Levene’s方差齐性检验显示5个样品总体方差齐(P=0.138),方差分析结果表明,5个样品间ATM基因的表达有差异(F=4.750,P=0.021)采用方差齐的多重比较方法LSD法进行两两比较,结果显示：4个转染样品的ATM基因的表达水平均低于对照样品(各P值<0.05)。样品HepG2-mir7-ATM-4中ATM基因的表达水平低于其他样品(各P值<0.05)。3、通过γH2AX检测技术,比较沉默ATM基因前后在各时间点和剂量点DSB损伤及其修复的水平。各组数据均计算50个细胞γH2AX焦点数,根据析因分析结果表明：不同时间点测得的y H2AX焦点数存在差异(F值=2461.60,P<0.001)。结合(图2-2,2-3)可知,照射后24小时检测DNA损伤明显较前少。两组细胞间测得的γH2AX焦点数也存差异,(F值=499.45,P<0.001),结合(图2-4,2-5),两组细胞间在不同时间点检测到DNA损伤有差异,且经过DNA修复后两组细胞DNA损伤差异趋势有所增大。根据(表2-2,2-3)DNA修复前后所测得的γH2AX焦点数变化情况的分析：除对照组外,各剂量组在经约24小时的DNA修复后,γH2AX焦点数存在明显差异(各P值<0.001)。表明经约24小时DNA修复后,各组γH2AX焦点数有不同程度的减少。结论1、成功构建了4个待选的干扰载体；经过比对,重组克隆中插入片段序列与设计的oligo序列完全一致。2、通过qPCR检测HepG2+ mir7-ATM-4对ATM基因沉默效率最佳。3、通过γH2AX检测技术,计算各组中平均焦点数可知,ATM基因沉默前后/剂量组间及不同时间点检测的γH2AX焦点数存在差异。表明HepG2细胞经沉默ATM基因,阻碍了主要由ATM介导的同源重组修复途径,使DNA双链断裂修复下降,DNA损伤增多。即抑制ATM的表达可以抑制同源重组途径修复DNA双链断裂,影响了DNA的损伤修复。