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葡萄果梗褐变是造成鲜食葡萄果穗品质下降的第二大重要问题,也是鲜食葡萄贮藏新技术发展的主要障碍。为了改善葡萄采后果梗褐变问题,本文以新疆主栽品种“Thompson Seedless”无核白葡萄为研究试材,通过NO熏蒸技术筛选适宜浓度后,采用RNA-seq技术探索了果梗褐变相关的主要代谢途径、通路及其基因,根据NO响应差异和基因功能验证并确定候选基因,以苯丙烷代谢途径为重点,探讨葡萄果梗褐变发生规律及其调控机制,旨在为NO在葡萄采后贮藏技术领域的应用提供科学依据和实验数据。主要结果如下:(1)筛选并优化了NO熏蒸浓度。NO气体熏蒸处理具有延缓葡萄果梗褐变、维持葡萄果粒品质的生理作用,但NO浓度低于300μL·L-1发挥作用有限,400μL·L-1~600μL·L-1时抑制果梗褐变的作用效果明显,大于900μL·L-1时反而有伤害作用。分析贮藏效果发现,NO可有效降低葡萄失重率、落粒率、腐烂率,减缓葡萄果粒硬度、可溶性固形物和总酸的下降,其中500μL·L-1NO熏蒸浓度显著减缓了葡萄果梗电导率的增加,抑制了叶绿素降解和花青素的积累,尤其延缓了叶绿素a向叶绿素b的降解速度,降低了果梗黄化速度,但对黄酮类含量影响不显著;该浓度的NO处理不仅减少了果梗表面裂纹数量和开裂强度,而且有益于内部细胞排列紧密、骨架完整的形态的保持,从而减轻了局部组织的凹陷程度;减缓了木质部中的无机物的消耗,从而延缓了细胞结构的破坏。组织染色分析发现,NO维持了果梗表皮细胞的体积,减缓了细胞壁增厚和木栓化,抑制了表皮棕色物质的积累。(2)RNA-seq测序表明,贮藏期间的葡萄果梗mRNA的转录变化明显,且NO处理对其影响作用显著。不同贮藏阶段的葡萄果梗共表达基因有12869个,在采收10 d时,上调基因数占总差异基因的72.35%,下调基因数占总差异基因的27.65%。与采收时相比,贮藏10 d时处理组和对照组的差异表达基因合计有759个,而共有差异基因62个,靠前的32个基因qPCR表达验证显示,有20个基因表达特性突出,其中PAL1,PAL3-5,PPO1-3,POD1,POD4-7和转录因子WRKY53,ERF003,MYB39表达量明显高于PAL2,POD2-3和转录因子b HLH96,ERF095。而NO处理均对上述基因有不同程度的调控作用,尤其在冷藏5 d~25 d和货架前两天的作用较为明显。(3)GO、KEGG和蛋白富集表明,苯丙烷代谢途径与葡萄果梗褐变进程关系紧密,主要涉及PAL、PPO和POD家族基因。RNA-seq数据表明,有365个DEGs参与了50个代谢途径,主要分布在代谢过程,占总DEGs的81.10%(296个),而且被DEGs富集的主要途径有苯丙素生物合成途径,占比为11.82%(35个);其次为苯丙氨酸代谢途径,占比为9.80%(29个);紧随其后的还有植物激素信号转导途径、黄酮类合成途径;富集到前2条的DEGs占代谢类总条目的21.62%(42条),成为主要富集方向。另外,排名前三的通路依次为苯丙素生物合成途径(KO00940)、苯丙氨酸代谢途径(KO00360)和黄酮类生物合成途径(KO00941)。结合基因功能选则与果梗褐变相关的苯丙烷代谢途径为转录分析重点,候选基因有9个,即VvPPO1-3,VvPAL1-3和VvPOD1-3。(4)相关性分析表明,果梗褐变指数和PPO活性变化与理化品质、候选基因变化特点紧密相关,且不同基因表达特性差异显著。其中褐变指数与酚类含量、POD、VvPAL1和VvPOD3存在显著相关,与失水率、PPO、VvPPO1和VvPOD1存在极显著相关。同时,PPO与VvPOD1呈显著相关,与VvPPO1呈极显著相关。比较发现,普通采后果梗中VvPPO1表达显著高于VvPPO2(7.05倍)和VvPPO3(5.56倍)。VvPAL2显著高于VvPAL1(5.12倍)和VvPAL3(2.13倍)。VvPOD3显著高于VvPOD1(4.35倍)和VvPOD2(21.81倍)。因此,葡萄果梗中VvPPO1、VvPAL2和VvPOD3可能是其家族基因中表达量较高的基因。(5)转录调控研究表明,NO熏蒸处理诱导苯丙烷代谢的调控作用显著。主要体现在500μL·L-1NO延缓了葡萄果梗中水分损失、减少了酚类物质积累、抑制了PPO和PAL活性、诱导了POD活性增加;下调了基因VvPPO1、VvPAL2和VvPAL3的表达,上调了VvPOD3的表达;VvPPO1-3表达谱表明,VvPPO1是一个重要基因,NO处理对VvPPO1有显著的抑制作用(P<0.01),但对VvPPO2和VvPPO3作用不显著。结果表明,VvPPO1在果梗褐变产生和控制方面起到了至关重要的作用,可能是VvPPO家族中与果梗褐变有关的关键基因。(6)生物信息学分析和亚细胞定位观察表明,VvPPO1具有酪氨酸结构域,在叶绿体上行驶功能。VvPPO1全长为2010bp,包含2007 bp ORF,编码668个氨基酸残基,分子式为C3346H5215N909O987S23,原子总数为10480,分子量为74.71KDa,理论p I为6.64,具有跨膜特性,没有信号肽,半衰期为30 h,定位于叶绿体中;与Vitis vinifera“Shine Muscat”(BAO79387.1)亲缘关系较近,相似度大于99%;序列提交至Genbank数据库,获得基因登录号为MN164611。