促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究

来源 :石河子大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lsy5
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
绵羊是一种非常重要的家养动物,利用基因修饰手段来改良或育种是一个方向。目前利用转基因技术进行分子育种,存在较难控制外源基因与效率较低等问题。基于小鼠胚胎干细胞(ESC)的基因打靶技术能进行精确有效的敲入或敲出。由于绵羊ESC很难分离获得,利用同样具有多能性的诱导多能干细胞(iPSC)代替ESC进行精确遗传工程操作成为目前急需解决的问题。目前绵羊的iPSC存在诱导效率低,难以获得完全重编程的iPSC的问题。microRNA是基因表达转录后的调节器,研究证明ESC特异性的miRNAs能促进体细胞重编程。因此,筛选能促绵羊体细胞重编程的miRNAs,并探讨其重编程机制,有望建立一种高效获得绵羊iPSC的体系,对优质绵羊培育具有应用价值,也为获得绵羊ESC奠定基础。生殖细胞是唯一将基因组和表观遗传信息传递给下一代的细胞谱系,但在体外重建生殖细胞发育一直是生物学研究的挑战。随着小鼠多能干细胞在体外可以分化为原始生殖细胞样细胞(PGCLC),进而发育为卵母细胞并能进行生殖系传代,为绵羊多能干细胞在体外生产PGC提供了理论依据和方法。研究绵羊iPSC定向分化为雌性PGCLC,为绵羊PGC的发育研究可以提供一种细胞模型,为后期分化为功能卵子奠定了基础,对提高绵羊优质配子利用,加快畜群的改良速度具有重要的应用价值。目的:(1)筛选出能促进绵羊体细胞重编程的microRNA;(2)初步探索microRNA在绵羊体细胞重编程过程中的机制;(3)建立一种利用绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞的方法。方法:(1)组织块法分离培养妊娠45d左右的绵羊胎儿肾细胞(SKC),作为重编程的起始细胞;胰酶消化法分离CF-1小鼠胎儿成纤维细胞(MEF),丝裂霉素C处理后,作为诱导绵羊iPSC的饲养层细胞。(2)结合文献报道和数据库综合分析在小鼠和人干细胞中高表达或可促进重编程的miRNAs,筛选出可能促绵羊体细胞重编程的miR302/367簇、miR200b-200a-429簇、miR200c-141簇,并包装慢病毒;同时将Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Nanog、Lin28、SV40T、h TERT等八种人源转录因子包装慢病毒;利用不同慢病毒感染SKC进行诱导重编程,通过碱性磷酸酶(AP)染色统计诱导效率,筛选出可促进绵羊体细胞重编程的最优miRNA;并对获得的绵羊iPSC从AP染色、实时定量PCR、细胞免疫荧光、核型分析、甲基化测序分析、拟胚体分化这几个方面进行鉴定。(3)利用miRbase和Target Scan等生物信息平台预测miR-200c靶基因,并送公司合成oar-miR-200c模拟物、抑制物和阴性对照;设计引物,克隆靶基因结合位点的3’UTR区及突变3’UTR,构建ZEB1和TWISTNB靶基因的双荧光素酶报告分析载体。(4)通过oar-miR-200c mimics转染细胞,利用荧光素酶报告载体分析与靶基因的作用;利用qRT-PCR检测靶基因的转录水平;利用Western blot检测靶基因的蛋白水平;探讨oar-miR-200c在绵羊体细胞重编程过程的作用机制。(5)设计引物,扩增克隆绵羊生殖相关基因DAZL和BOULE,并构建慢病毒载体PLVX-Dazl和PLVX-Boule,并进行包装慢病毒。(6)组织块法分离培养原代绵羊卵巢细胞;DAZL和BOULE慢病毒感染绵羊iPSC,建立转基因绵羊iPSC;通过摸索培养体系和条件,利用绵羊iPSC定向分化原始生殖细胞;利用qRT-PCR检测绵羊生殖细胞特异因子的转录水平,利用Western blotting检测生殖细胞特异因子的蛋白水平。结果:(1)成功分离绵羊体细胞SKC,其表达角蛋白CK18;成功分离小鼠CF-1MEF细胞,并制备饲养层细胞,能很好的支持siPSC生长。(2)筛选的三个miRNA簇,成功包装miRNA慢病毒;成功包装8种转录因子的慢病毒;慢病毒感染绵羊SKC后,通过诱导效率比较分析,筛选出miR-200c-141簇可将重编程效率提高到0.95%;获得的绵羊iPSC经鉴定呈阳性;(3)成功构建miR-200c靶基因ZEB1和TWISTNB的双荧光素酶报告载体;(4)双荧光素酶报告分析,oar-miR-200c靶向ZEB1和TWISTNB的3’UTR;qRT-PCR和Western blotting检测oar-miR-200c可显著降低ZEB1和TWISTNB基因的表达,但可增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率;(5)成功构建绵羊生殖相关基因慢病毒载体LVX-Dazl-F2A-mcherry-IRES-NEO和PLVX-Boule-F2A-mcherry-IRES-NEO,并成功包装慢病毒;(6)成功建立稳转Dazl和Boule基因的绵羊iPSC,在培养液中添加Activin A、bFGF、BMP4、LIF、EGF等因子及卵巢细胞培养上清,可使绵羊iPSC分化为PGC样细胞,分化第八天可表达生殖相关标记蛋白PRDM1、PRDM14和VASA,其基因Dazl、Boule、Prdm14和Vasa的mRNA转录呈高水平状态。结论:(1)成功筛选出miR-200c-141可以促进绵羊体细胞重编程为iPSC;(2)oar-miR-200c靶向Zeb1和Twist NB基因的3’UTR,显著降低Zeb1和Twist NB表达水平,增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率。(3)利用生殖系相关基因DAZL和BOULE的慢病毒感染绵羊iPSC,在添加activin A、b FGF、BMP4、LIF、EGF等因子的条件下,可以将绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞。
其他文献
齐泽克电影批评承接拉康的理论脉络,用某个人物、细节形象生动地阐发了原本深奥的欲望,以求大众化、通俗化拉康理论。但是,精神分析的欲望理论过于依赖主观预设的观念,悖离形而下的日常经验,与电影中具有确定性与满足感以及"人格化"的欲望格格不入。电影的欲望就是存在某种目标的"我真要";电影叙事就是通过一段虚拟的人生使观众获得欲望的满足。因此,齐泽克以《绿窗艳影》《三妻艳史》《马耳他之鹰》《迷魂记》《蓝丝绒》
期刊
红军长征有相当长的一段时间在贵州,贵州地区多民族、多宗教的情况比较复杂,境内佛、道、伊、天、基五大宗教和民间宗教并存。红军长征在贵州时期,我们党采取了积极有效的宗教政策,保障当地民众的宗教信仰,争取信教群众和宗教界人士的支持和拥护,以利红军顺利进军。党的宗教政策在贵州的实践,至今对我们都有重要的启示。
期刊
古人有云,"艳质奇葩"仍不可逃"枯荣开落",可宝相花绽于金银器皿、织物、铜镜、壁画等,千年不朽,万古不灭,为后人道也。宝相花作为最具代表性的中国传统装饰纹样之一,被屡屡提及,但专门探讨何家村窖藏金银器中宝相花纹样者,却不多见。宝相花与唐代金银器
期刊
对许多小学生来说,练字是一件枯燥乏味的事情,如何使学生变被动为主动,合适的教学方法的运用尤其重要。对比教学法,可以让学生抓住事物的异同性进行比较,从复杂的现象中迅速抓住实质。笔者结合实践研究表明,在小学书法课程中运用对比教学法进行教学,可以达到如下目标:养成读帖好习惯,激发学生乐于写好字的兴趣;形成良好的书写意识,培养学生写好字的能力;培养审美鉴赏能力,提升学生的书法素养。
唐代是铜镜发展的繁荣时期,金银平脱宝相花铜镜是唐代最具代表性的铜镜之一。从设计美学的角度审视,金银平脱宝相花铜镜蕴含着技术美、纹样美、造型美。在观照唐代社会现状、了解唐代历史文化的基础上,探索唐代金银平脱宝相花铜镜的文化内涵和设计美学,对于当代器型的设计理念及工艺设计有一定的启示意义。
清代青花宝相花八吉祥纹尊高49.5厘米,口径长19.7厘米,足径为21.5厘米。该尊为侈口,束颈,鼓腹,圈足。尊颈部饰缠枝宝相花,肩部饰八吉祥图案,腹下部绘有仰莲瓣纹,口沿和圈足饰海水江牙,共有八组纹饰组成整体画面。宝相花是一种具有象征意义的花,它集中了莲花、牡丹、菊花的特征,经过艺术处理后变得更圣洁、更端庄、
期刊
番茄(Solanum lycopersicum)是世界种植最为广泛的蔬菜作物之一。番茄生产过程中容易遭受各种生物和非生物胁迫,对其产量和产品质量都造成了严重影响。栽培番茄是一种喜温作物,低于13℃的温度下生长发育缓慢、叶片萎蔫,还可能造成落花落果,果实畸形等。因此,低温是影响番茄分布、生长发育和生产力的主要非生物因素之一。此外,番茄生产还经常受到灰霉病菌(Botrytis cinerea)等生物因
哈密瓜营养丰富,素有“瓜中之王”的美称。新疆哈密瓜依赖着独特的地理位置和生态环境资源造就了优质的品质。新疆哈密瓜总产量约占全国哈密瓜产量半数以上,但在全国甜瓜中的竞争优势正在快速下降。哈密瓜属于新疆特色水果,对其开展采后品质检测有助于维护好新疆哈密瓜区域品牌的地位,并提升在国内外市场的竞争力。本论文立足新疆瓜果产业发展需求,系统性地开展了针对哈密瓜关键指标糖度和脆度的无损检测方法研究。主要研究内容
目的:膜下滴灌技术形成的灌水-蒸发空间不均匀作用使农田土壤呈现“水盐空间交错”的分布状态,土壤盐分主要聚集在膜外位置,在蒸发作用下形成盐分表聚特征,减弱了灌水对膜外土壤盐分的淋洗;而膜下滴灌条件下农田土壤产生盐分表聚与盐分淋洗现象共存的这一事实,使土壤盐分表聚量与盐分淋洗量之间存在一定的比例关系。本文通过室内物理试验及田间试验的验证,研究了水汽两相流作用下土气界面盐分的结晶过程,讨论了膜下滴灌条件