β-榄香烯是抗癌药物榄香烯中的有效成分,是从中药温郁金中提取分离而来的。由于其抗癌谱广,疗效确切,且毒副作用轻微,目前临床上可用它治疗多种恶性肿瘤。因而提高β-榄香烯的产量对于医学、药学以及生命科学等众多领域都具有重大的研究意义。体外多酶催化是在体外反应体系中加入纯化好的酶以及辅酶,使底物经历顺序的多步反应,获得最终目标产物的过程。相对于传统的利用生物体内的代谢途径合成目标产物,体外催化能减少宿主细胞自身对某些物质的代谢需求,使反应体系中的酶全部用于催化最终产物的生成,具有产量高,速率高,生物条件易控制,产物易分离,底物可选择性等优点,成为合成生物学领域发展非常迅速的一种研究方法,且它可以不去阐明生物体内复杂的细胞代谢,大大提高了研究效率。本研究利用已经阐明的生物体内甲羟戊酸途径合成β-榄香烯中的相关代谢酶,成功地体外过量表达了MVA下游途径的5个酶(MK,PMK,MVD1,idi,ispA),其表达的可溶性蛋白占到总蛋白的90%。本研究通过镍柱亲和层析的纯化方法,得到了这5个纯酶,其浓度分别为0.9 mg/mL、0.8 mg/mL、2.5 mg/mL、1.1 mg/mL、1.2 mg/mL。吉马烯A合酶是生物合成β-榄香烯过程中催化前体物质法尼基焦磷酸(FPP)生成吉马烯A的关键酶,产物吉马稀A在体外可以通过简单Cope重排直接获得β-榄香烯。本研究选取了西洋蓍草来源的GAS,并成功地进行了体外过量表达,实验结果显示,与蓝细菌来源的GAS(包涵体占76%)相比,西洋蓍草来源的GAS表达的可溶性蛋白占到总蛋白的80%,由此得到了可溶性更高GAS,并通过镍柱纯化得到了纯酶,其浓度为1.2 mg/mL。将纯化得到的MVA下游途径的5个酶以及西洋蓍草来源的GAS进行体外催化反应,气相检测无明显的目标产物的峰,对结果进行分析,可能是酶纯化后在体外常温条件下活性降低,催化能力很弱,因此如何提高酶在体外反应中的活性成为下一步研究的方向。比如可以通过DNA分子支架、蛋白支架等构建底物通道,或者将酶进行固定化等,都可以很好地提高酶的催化活性。综上实验结果,本研究得到了高可溶性的MVA下游途径的5个酶以及催化FPP生成β-榄香烯前体物质吉马烯A的GAS蛋白,并初步实现了MVA途径生物合成β-榄香烯前体物质的相关代谢酶的体外催化,为实验室后续进一步提高β-榄香烯前体物质的体外合成的继续优化,奠定了良好的基础。